Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

Résumé

L’actine filamenteuse (F-actine) joue un rôle important dans la spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. La quantification de l’actine F est donc un outil utile pour étudier l’intégrité des structures synaptiques. Ce protocole décrit les procédures de quantification des points d’actine F marqués à la phalloïdine dans des cultures neuronales corticales primaires de faible densité.

Résumé

Filamenteux protéine d'actine (actine F) joue un rôle majeur dans spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. L'évolution des structures riches dendritiques F-actine suggèrent des modifications dans l'intégrité synaptique et la connectivité. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la culture de rat primaires neurones corticaux, phalloïdine coloration pour puncta F-actine, et les techniques de quantification ultérieures. Tout d'abord, le cortex frontal des embryons de rat E18 sont dissociées dans une culture de cellules de faible densité, alors les neurones cultivés in vitro pendant au moins 12-14 jours. Après un traitement expérimental, les neurones corticaux sont colorées avec AlexaFluor 488 phalloïdine (pour marquer les points lacrymaux F-actine dendritique) et associée aux microtubules protein 2 (MAP2; pour valider les cellules neuronales et l'intégrité dendritique). Enfin, un logiciel spécialisé est utilisé pour analyser et quantifier les dendrites neuronales choisis au hasard. F-actine structures riches sont identifiés sur le deuxième ordre branches dendritiques (gamme 25-75 et de la longueur# 181; m) avec immunofluorescence MAP2 continue. Le protocole présenté ici sera une méthode utile pour étudier l'évolution des structures des synapses dendritiques subséquentes à des traitements expérimentaux.

Introduction

L'objectif principal de cette étude est de développer une méthode fiable de mesure (estimation) de l'intégrité synaptique du réseau dendritique neuronale. Nous décrivons ici la quantification des points lacrymaux F-actine dans rat primaire des neurones en culture en utilisant une combinaison de phalloïdine coloration et immunocytochimique (ICC) détection des dendrites avec une analyse ultérieure en utilisant (NIS-Elements) spécialisée logiciel.

Phallotoxins marquées ont une affinité similaire pour les grands et petits filaments (F-actine), mais ne se lient pas à monomère actine globulaire (G-actine), contrairement à certains antic....

Protocole

Tous les protocoles d'animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université de la Caroline du Sud (numéro d'assurance: A3049-01).

1. basse densité neuronale embryonnaire Culture

1. Préparation pour la culture de neurones corticaux primaires
   1. Solutions:
      1. Préparer Poly-L-lysine solution mère en dissolvant 5 mg de poly-L-lysine dans 10 ml de tampon borate.
      2. Préparer la solution de travail en diluant 1 ml Poly-L-lysine Stock dans 49 ml Tampon borate.
      3. Préparer un tampon de borate, pH 8,4 en commençant par 395 DH _{2 O,}

Résultats

Dans les présentes méthodes, nous avons d'abord rat de culture de neurones corticaux à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, ce qui nous permet d'identifier les dendrites des neurones individuels. Sur la figure 1, le contraste interférentiel différentiel (DIC) images montrent les changements morphologiques dans le développement foetal neurones corticaux de rat aux jours 4, 6, 10, 14, 21 et 27 in vitro. A noter que la longueur et le nomb.......

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons la culture de neurones corticaux de rat à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, qui nous permet d'identifier les dendrites des neurones individuels. Ensuite, nous utilisons phalloïdine et MAP2 coloration pour détecter les changements dendritiques. Ensuite, nous avons utilisé un logiciel spécialisé pour quantifier les changements dans puncta F-actine.

Pour déterminer les changements dans puncta F-actine l'ensemble du réseau neuronal .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plats à fond en verre de 35 mm n° 1.5 coverglass	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
Acide borique	Sigma	B0252
Borax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucose	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B-27 supplément	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiotique-Antimycosique solution	Cellgro	30004CI	100X
Bicarbonate de sodium	Life Technologies	25080
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 Forceps	World Instruments de précision	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldéhyde  ;	Sigma	P6148
Verre de couverture	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Sérum de cheval normal	Life Technologies	26050-070
Poulet polyclonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594 Chèvre conjuguée anti-poulet IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Coloration à cellules vivantes ReadyProbes Réactif Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements progiciel	Nikon Instruments
TE2000-E microscope fluorescent inversé contrôlé par ordinateur  ;	Nikon Instruments
0.2 &mu ; m Filtre à membrane en nylon Nalgene	Fishersci	151-4020

Nikon Eclipse