Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode Caenorhabditis elegans

Summary

Ici, nous détaillons des protocoles spécifiquement conçus pour surveiller les défauts morphogéniques qui se produisent pendant les phases précoces et tardives de l’élongation embryonnaire du nématode Caenorhabditis elegans. En fin de compte, ces protocoles sont conçus pour identifier les gènes qui régulent ces phases et pour caractériser leurs besoins différentiels le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Abstract

La dissection des voies de signalisation qui contrôlent l’altération des processus morphogéniques au cours du développement embryonnaire nécessite des mesures robustes et sensibles. L’allongement embryonnaire du nématode Caenorhabditis elegans est un stade tardif de développement consistant en l’allongement de l’embryon le long de son axe longitudinal. Cette étape de développement est contrôlée par la communication intercellulaire entre les cellules hypodermiques et les muscles sous-jacents de la paroi corporelle. Ces mécanismes de signalisation contrôlent la morphologie des cellules hypodermiques en remodelant le cytosquelette et les jonctions cellule-cellule. La mesure de la létalité embryonnaire et de l’arrêt du développement aux stades larvaires, ainsi que l’altération du cytosquelette et des structures d’adhésion cellule-cellule dans les cellules hypodermiques et musculaires, sont des phénotypes classiques qui sont utilisés depuis plus de 25 ans pour disséquer ces voies de signalisation. Des études récentes ont nécessité la mise au point de nouvelles mesures ciblant spécifiquement l’élongation précoce ou tardive et caractérisant les défauts morphogéniques le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés permettant de mesurer avec précision la longueur et la largeur des embryons allongés ainsi que la longueur des larves synchronisées. Ces méthodes constituent des outils utiles pour identifier les gènes contrôlant l’élongation, pour évaluer si ces gènes contrôlent à la fois les phases précoces et tardives de ce stade et sont nécessaires uniformément le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Introduction

Depuis près de 50 ans , les nématodes Caenorhabditis elegans est établi comme un modèle puissant pour étudier des questions importantes dans le développement, la neurobiologie, l' évolution, les interactions hôte-pathogène, etc. ¹ La force de ce modèle dans l'étude du développement réside dans: son cycle de vie court de 3 jours; la facilité avec laquelle ces animaux peuvent être génétiquement modifiées; sa transparence qui permet l'observation du déplacement de la cellule et de la morphologie des animaux vivants et de son développement qui est la plupart du temps extra-utérine. Les stades de développement du nématode impliquen....

Protocol

1. Caractérisation des défauts Allongement précoce dans WT et mutantes Animaux

1. Embryons de montage pour Normarski DIC Microscopie
   1. Préparer les médias et le matériel de culture suivants:
      1. M9 tampon, dissoudre 12,8 g / l de Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O 3 g / KH ₂ PO _4, L 5 g / L de NaCl, 0,25 g / l MgSO ₄ • 7H ₂ O dans de l' eau distillée et l' autoclave pour stériliser.
      2. Des plaques NGM, dissoudre 3 g / L de NaCl, 16 g / l d' agar, 2,5 g / l bactopeptone dans ddH ₂ O. Autoclaver et ajoute 1 mM de MgS....

Results

Head-, caudales et Chef / Ratio de queue-largeur sont Metrics robustes.

Les protocoles décrits ici ont été utilisés avec succès pour caractériser la fonction des régulateurs et des effecteurs de Rho GTPases pix-1, pak-1 et laissez-502 lors de l' allongement précoce ^7........

Discussion

Ce protocole décrit les nouveaux paramètres pour caractériser début et fin des phases d'allongement embryonnaire.

Dans la section 1, l'étape critique est la présence potentielle de bactéries sur le pad. Les embryons sont hermétiquement enfermés entre le patin et la lamelle lors de l'acquisition d'image. La lame d'étanchéité est nécessaire pour éviter la dessication des animaux lors de l'acquisition d'une durée de plus de deux heures. À notre connaissance, aucun de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar  ;	BioShop	AGR001.500
Agarose	Bioshop	AGA001.500
CaCl2 (Chlorure de calcium)	Bio Basic Inc.	CT1330
Cholestérol	Sigma-aldrich	C8667
Solution de nettoyage  ;	union Biometrica	300-5072-000
Lamelles en verre	Fisherbrand	12-542B
Lames en verre	Fisherbrand	12-552-3
Particules de contrôle à haute fluorescence	union Biometrica	310-5071-001
K2HPO4 (phosphate de potassium, dibasique)	Bio Basic Inc.	PB0447
K2HPO4 (phosphate de potassium, monobasique)	Bio Basic Inc.	PB0445
MgSO4 (sulfate de magnésium)	Sigma-aldrich	230391
Na2HPO4(phosphate de sodium, dibasique)	Bio Basic Inc.
NaCl (chlorure de sodium)	Bio Basic Inc.	DB0483
Pébéo Gomme à Dessin 45  ; ML	Pé ; bé ; o	PDG033000	tout magasin d’art/artisanat
Peptone	BioShop	PEP403.500
Tampon gaine	union Biometrica	300-5070-100
COPAS Biosort	union Biometrica