Gradient stamme Chip nemlig stimulere cellulære opførsel i celle-belæsset Hydrogel
Summary
Denne artikel introducerer en enkel metode til at give ikke-fortløbende gradient statisk stammer på en koncentrisk celle-belæsset hydrogel til at regulere cellejustering for vævsmanipulering.
Abstract
Kunstige vejledning for cellulære justering er et varmt emne i feltet af vævsmanipulering. De fleste af de tidligere forskning har undersøgt enkelt stamme-induceret cellulære justering på en celle-belæsset hydrogel ved hjælp af komplekse eksperimentelle processer og masse kontrol systemer, som er normalt forbundet med forurening spørgsmål. Således, i denne artikel, vi foreslår en simpel tilgang til opbygning af en gradient statisk belastning ved hjælp af en fluidic chip med en plastik PDMS dækning og en UV gennemsigtigt glas substrat for stimulering af cellulære adfærd i en 3D hydrogel. Overbelastning foto-patternable celle prepolymer i fluidic salen kan generere en konveks buede PDMS membran på forsiden. Efter UV crosslinking, gennem en koncentrisk cirkulære micropattern under den buede PDMS membran, og buffer vask, en mikromiljø for behandlende celle adfærd under en række af gradient stammer er selv etablerede i en enkelt fluidic chip, uden eksterne instrumenter. NIH3T3 celler blev påvist efter at observere ændringer i den cellulære justering tendens under geometri vejledning, i samarbejde med stamme stimulation, som varierede fra 15-65% på hydrogels. Efter en 3-dages inkubation dominerede hydrogel geometri cellejustering under lav trykstyrke stamme, hvor cellerne justeres langs hydrogel brudforlængelse retning under høj trykstyrke stamme. Mellem disse celler viste tilfældige justering som følge af spredning af den radikale ledelse af hydrogel strækforlængelse og geometri vejledning af den mønstrede hydrogel.
Introduction
Tjener som en blok materiale, der efterligner en native mikromiljø, kan en hydrogel, som indeholder ekstracellulære matrix (ECM) genetablere opbygge biomimetiske væv stilladser til støtte for cellevækst. Til at besidde funktionerne af en væv, er organiseret cellejustering en væsentlig forudsætning. Forskellige 2D (dvs. celler dyrkes på en overflade) og 3D (dvs. celler indkapslet i en hydrogel) celle alignments har opnået ved dyrkning eller indkapsle celler i eller på fleksible substrater med mikro- eller nano-mønstre1. 3D cellejustering i mikroarkitekturen er mere attraktive, da mikromiljø er tættere på den indfødte væv konstruere2,3,4. En almindelig metode til 3D cellejustering er den geometriske cue hydrogel figur2,3. På grund af den begrænsede plads til celleproliferation i kort-akse retningen, celler har til formål at bringe langs lange-akse retningen i en mikro-mønstrede hydrogel. En anden metode er at anvende trækstyrke strækning til hydrogels at opnå cellejustering parallelt med stretch retning4,5.
Biofysiske stimulation på ECM hydrogels, såsom trykstyrke stamme eller et elektrisk felt, kan regulere cellefunktioner for ordentlig væv integration, spredning og differentiering1,2,3. Megen forskning er blevet gjort for at undersøge cellulære adfærd ved at anvende én stamme tilstand ad gangen ved hjælp af flere mekaniske kontrol enheder4,6,7,8,9. For eksempel, brug af mekaniske trin motors klemt eller strakt på en 3D celle-indkapslede kollagen hydrogel har været en fælles tilgang7,10. Men sådanne kontrollerende udstyr kræver ekstra plads og står over for spørgsmålet om forurening i inkubator7,9,11,12. Derudover kan ikke det store instrument give en præcis kontrolmiljø at give høj reproducerbarhed13.
I betragtning af, at celle-laden hydrogels normalt er beskæftiget på mikro-skalaen for biomedicinske programmer, er det en fordel at kombinere MEMS teknikker for at generere en række stamme/stretch stimulation til samtidig undersøge celle adfærd i 3D biomimetiske konstruktioner in vitro-2,14,15,16,17,18. For eksempel kan bruger gas pres til at deformere PDMS membran i mikrofluid chips give anledning til forskellige stammer, køre Celledifferentiering til forskellige slægter9,16. Men der er mange tekniske udfordringer, såsom komplicerede chip fabrication processer i et rent værelse og software kontrol integration af motorer, pumper, ventiler og komprimerede gasser.
I dette arbejde viser vi en enkel tilgang for at opnå en selvbærende gradient statisk-stamme mikrofluid chip ved at ansætte en koncentrisk cirkulære hydrogel mønster og en fleksibel PDMS membran. I modsætning til de fleste af de eksisterende metoder er vores platform en transportabel og engangs miniature enhed der kan fremstilles uden for en gul stue og der besidder selv generere gradient stammer på koncentriske celle-indkapslede hydrogels, uden ydre mekanisk udstyr under inkubation. 3T3 fibroblast celle adfærd påvirkes af en kombination af hydrogel form og en bred vifte af trækstyrke stretch vejledning stikord blev påvist under observation af cellejustering i 3D ECM-mimetiske miljøer i gradient stamme chip for 3 dage.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette papir rapport vi om en enkel metode til at sammenligne celle justering adfærd efter hydrogel figur vejledning og trækstyrke strækning. En fleksibel PDMS membran skaber en dome-formet krumning til at generere forskellige højder af koncentriske cirkulære hydrogels. Efter at slippe trykket, gælder PDMS membran automatisk kraft til den mikro-mønstrede hydrogels at danne gradient stamme/strækforlængelse, med et maksimum i midten og et minimum ved den ydre grænse. Som dannelsen af den gradient stamme er desig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev støttet af den Graduate studerende undersøgelse i udlandet Program (NSC-101-2917-I-007-010); Programmet Biomedicinsk teknik (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); og nanoteknologi nationale Program (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council af R.O.C., Taiwan. Forfatterne vil gerne takke professor Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul og Ronglih Liao på Harvard Medical School for at dele den hydrogel og celle indkapsling teknologi.
Materials
| 1.5-mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5-mL tube covered with aluminun foil |
| 10X DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-Induced Alignment in Collagen Gels. PLoS One. 4 (6), e5902 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
