Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

Summary

Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering aan het verstrekken van niet-continu verlopende statische spanningen op een concentrische cel-beladen hydrogel te reguleren celuitlijning voor weefselengineering.

Abstract

Kunstmatige begeleiding voor cellulaire uitlijning is een hot topic op het gebied van weefselengineering. Allermeest naar de vorige onderzoek heeft één stam-geïnduceerde cellulaire uitlijning op een cel-beladen hydrogel onderzocht met behulp van complexe experimentele processen en massale controle systemen, die meestal geassocieerd met besmetting kwesties. Dus, in dit artikel stellen wij een simpele aanpak aan de opbouw van een kleurovergang statische belasting met behulp van een fluidic chip met een plastic PDMS cover en een UV transparant glas substraat voor de stimulatie van cellulaire gedrag in een 3D hydrogel. Overbelading foto-patternable cel prepolymeren in het fluidic kamer kunt genereren een convex gebogen PDMS membraan op de cover. Na UV crosslinking, via een concentrische circulaire micropattern onder de gebogen PDMS membraan, en buffer wassen, een communicatie voor behandelende cel gedrag onder een verscheidenheid van kleurovergang stammen is zelf gevestigd in één fluidic chip, zonder externe instrumenten. NIH3T3 cellen werden aangetoond na het observeren van de verandering in de trend van de cellulaire uitlijning onder begeleiding van de meetkunde, in samenwerking met de stimulatie van de stam, die van 15-65% op hydrogels variëren. Na een 3-daagse incubatie domineerde de hydrogel geometrie de celuitlijning onder lage druksterkte stam, waar cellen uitgelijnd langs de hydrogel rek richting onder hoge druksterkte stam. Tussen deze toonden de cellen willekeurige uitlijning als gevolg van de afbraak van de radicale begeleiding van hydrogel rek en de richtsnoeren van de geometrie van de patroon hydrogel.

Introduction

Een blok-materiaal dat een inheemse communicatie bootst bijeenkomen, kan een hydrogel extracellulaire matrix (ECM) met herbouwen biomimetische weefsel steigers ter ondersteuning van de celgroei. Om te bezitten van de functies van een weefsel, is georganiseerde Celuitlijning een essentiële eis. Diverse 2D (dat wil zeggen, de cellen gekweekt op een oppervlak) en 3D (dat wil zeggen, de cellen ingekapseld in een hydrogel) cel uitlijning zijn bereikt door kweken of inkapselen van cellen in of op flexibele ondergronden met micro- of nano-patronen¹. 3D uitlijning in microarchitectuur is aantrekkelijker te maken, zoals de communicatie dichter bij de inheemse weefsel construct^{2,3,4 is}. Een gemeenschappelijke aanpak voor 3D Celuitlijning is de geometrische cue hydrogel vorm^2,3. Vanwege de beperkte ruimte voor celproliferatie in de richting van de korte-as willen cellen uitgelijnd langs de richting van de lange-as in een micro-patroon hydrogel. Een andere benadering is trekvast stretch beroep openstaan bij de hydrogels om Celuitlijning parallel aan de stretch richting^4,5.

Biofysische stimulatie op ECM hydrogels, zoals druksterkte stam of een elektrisch veld, kan reguleren cel functies voor goede weefsel integratie, proliferatie en differentiatie^1,2,3. Veel onderzoek is gedaan om te onderzoeken van cellulaire gedrag door één stam voorwaarde toe te passen op een moment met behulp van meerdere mechanische controle eenheden^4,6,7,8,9. Bijvoorbeeld is het gebruik van mechanische stap motors geperst of uitgerekt over een 3D cel-ingekapseld collageen hydrogel een gemeenschappelijke aanpak^7,10. Echter, dergelijke controlerende apparatuur vereist extra ruimte en geconfronteerd met het probleem van de besmetting in de incubator^7,9,11,12. Daarnaast het grote instrument niet het geven van een nauwkeurige controleomgeving te bieden hoge reproduceerbaarheid¹³.

Gezien het feit dat de cel-beladen hydrogels meestal op de micro-schaal voor biomedische toepassingen worden ingezet, is het voordelig om te combineren MEMS technieken voor het genereren van een aantal van de stam/stretch stimulatie te onderzoeken gelijktijdig cel gedrag in 3D biomimetische constructies in vitro^{2,14,15,16,17,18}. Bijvoorbeeld kan met behulp van gasdruk te vervormen het PDMS membraan in microfluidic chips aanleiding geven tot verschillende stammen, celdifferentiatie rijden naar verschillende geslachten^9,16. Er zijn echter vele technische uitdagingen, zoals de gecompliceerde chip fabricage processen in een schone kamer en de software controle integratie van motoren, pompen, afsluiters en samengeperste gassen.

In dit werk tonen we een eenvoudige benadering van een zichzelf onderhoudende kleurovergang static-stam microfluidic chip verkrijgen door gebruik te maken van een concentrische circulaire hydrogel patroon en een flexibele PDMS membraan. In tegenstelling tot de meeste van de bestaande benaderingen is ons platform een draagbare en wegwerp miniatuur-apparaat dat kan worden vervaardigd buiten een gele kamer en die bezit zelf genereren kleurovergang stammen op concentrische cel-ingekapseld hydrogels, zonder externe mechanische apparatuur tijdens de incubatie. 3T3 fibroblast cel gedrag beïnvloed door een combinatie van hydrogel vorm en een scala aan treksterkte stretch begeleiding signalen werden gedemonstreerd tijdens de observatie van de celuitlijning in 3D ECM-mimetische omgevingen in de kleurovergang stam-chip voor 3 dagen.

Protocol

1. GelMA Synthesis Weigh 10 g of gelatin powder and add it to a glass flask with 100 mL ofDulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS). Put a magnetic stir bar into the flask and place the flask on a stirring hot plate. Cover the flask with aluminum foil to avoid water evaporation. Set the hot plate temperature to 50-60 °C and the stirrer at 100 rpm for 1 h to dissolve the gelatin powder well. After the gelatin has dissolved, add 8 mL of methacrylic anhydride very slowly (one drop …

Representative Results

Om te vergelijken de mechanische variaties tussen elke circulaire hydrogel in de voltooide kleurovergang stam stimulatie-chip, we gemeten de breedte van de lijn van elke ronde hydrogel in twee van de dezelfde chips, met injectie hoeveelheid 0 µL (figuur 4a) en 40 µL (figuur 4b), respectievelijk. Het percentage versnellingen op elke cirkel werden berekend door de versnellingen in de 40 µL-geïnjecteerd chip door de breedte van …

Discussion

In deze paper rapporteren we op een eenvoudige benadering te vergelijken het uitlijningsgedrag cel na hydrogel vorm begeleiding en treksterkte rek. Een flexibele membraan PDMS creëert een koepel-vormige kromming voor het genereren van verschillende hoogtes van concentrische circulaire hydrogels. Na het loslaten van de druk, het PDMS membraan automatisch toegepast kracht op de hydrogels micro-patroon te vormen van de kleurovergang stam/rek, met een maximum in het midden en ten minste bij de buitenste rand. Zoals de vormi…

Materials

1.5-mL black microcentrifuge tube	Argos Technologies	03-391-161	This one can be replaced with a neutral color of 1.5-mL tube covered with aluminun foil
10X DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379
BSA	Sigma	A1595
Calcein	Molecular Probe	C1430	For labeling viable cells
CCD	PCO. Imaging	Pixelfly qe
Cell membrane permeating solution	Sigma-Aldrich	X100	0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Cell nucleus staining
Dialysis membrane	Sigma-Aldrich	D9527	Molecular weight cut-off = 14,000
DMEM	Gibco	11995-065
Double-side tape	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500	gel strength 300, type A, from porcine skin
High frequency electronic corona generator	Electro-technic products	MODEL BD-20
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685
Micro syringe	Hamilton	80501	50 μL
Microscope	Olympus	IX71	Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock
Oxygen plasma machine	Harrick plasma	PDC-001
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	For fixing cell
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication
Pen-Strep	Gibco	10378-016	penicillin/streptomycin
Photoinitiator	CIBA	Irgacure 2959
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170	For labeling dead cells
Sterile Filtration cup	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	For hydrogel immobilization
Ultrasonicator	Delta	D150H	150W, 43kHz
UV light	DAIHAN	WUV-L10
Freeze Dryer	FIRSTEK	150311025
NIH3T3(fibroblast)	Food Industry Research and Development Institute(FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini Automated Cell Counter	ORFLO	MXZ001