Gradiente di deformazione Chip per comportamenti stimolanti cellulari in cella-carichi idrogel

Summary

Questo articolo introduce un approccio semplice per fornire ceppi statici gradiente discontinuo su un idrogel di cella-carichi concentrici per regolare l’allineamento di cella per l’ingegneria tissutale.

Abstract

Guida artificiale per allineamento cellulare è un tema caldo nel campo dell’ingegneria tissutale. La maggior parte della ricerca precedente ha studiato singolo allineamento cellulare indotta da sforzo su un idrogel carichi di cella utilizzando processi sperimentali complessi e controllo impianti di massa, che sono associate solitamente con problemi di contaminazione. Così, in questo articolo, vi proponiamo un approccio semplice per creare un gradiente ceppo statico utilizzando un chip fluidico con una copertura di plastica PDMS e un substrato di vetro trasparente UV per la stimolazione del comportamento cellulare in un idrogel 3D. Sovraccarico prepolimero cella foto-derivativazione nella camera di fluidica può generare una membrana PDMS curva convessa sulla copertina. Dopo reticolazione UV, attraverso un micropattern circolare concentrico sotto la membrana PDMS curvilinea e tampone di lavaggio, un microambiente per inquirente cella comportamenti sotto una varietà di ceppi di gradiente è self-consolidata in un singolo chip fluidico, senza strumenti esterni. Le cellule NIH3T3 sono state dimostrate dopo aver osservato il cambiamento di tendenza allineamento cellulare sotto la Guida di geometria, in collaborazione con stimolazione del ceppo, che varia da 15-65% su idrogel. Dopo 3 giorni di incubazione, la geometria di idrogel dominato l’allineamento della cella sotto sforzo di compressione basso, dove le cellule allineati lungo la direzione di allungamento di idrogel sotto alta deformazione compressiva. Tra questi, le cellule hanno mostrato allineamento casuale a causa della dissipazione del Consiglio radicale di idrogel allungamento e la Guida di geometria dell’idrogel di fantasia.

Introduction

Che serve come un blocco di materiale che imita un microambiente nativo, un idrogel contenenti matrice extracellulare (ECM) può ri-costruire impalcature tessuto biomimetici per supportare la crescita delle cellule. Per possedere le funzioni di un tessuto, cellula organizzata allineamento è un requisito essenziale. Vari 2D (cioè, cellule coltivate su una superficie) e 3D (ad esempio, le celle incapsulate in un idrogel) gli allineamenti delle cellule sono stati raggiunti da coltura o incapsulamento di cellule in o su substrati flessibili con micro- o nano-pattern¹. Allineamento della cella 3D in microarchitettura è più attraente, come il microambiente è più vicino al tessuto nativo costrutto^2,3,4. Un approccio comune per l’allineamento di cella 3D è il cue geometrico di idrogel forma^2,3. A causa dello spazio limitato per proliferazione delle cellule nella direzione dell’asse corto, celle obiettivo allineare lungo la direzione di assi lunghi in un idrogel di micro-fantasia. Un altro approccio consiste nell’applicare a trazione Allungamento a idrogel per raggiungere celle allineamento parallelo alla direzione stretch^4,5.

Stimolazione biofisica su idrogeli di ECM, come deformazione compressiva o un campo elettrico, può regolare le funzioni delle cellule per integrazione tissutale adeguata, proliferazione e differenziazione^1,2,3. Gran parte della ricerca è stato fatto per studiare il comportamento cellulare mediante l’applicazione di una condizione di sforzo alla volta utilizzando più controllo meccanico unità^4,6,7,8,9. Ad esempio, l’uso di motori passo-passo meccanico spremuto o allungato su un idrogel di collagene 3D incapsulato delle cellule è stato un approccio comune^7,10. Tuttavia, tale apparecchiatura di controllo richiede spazio aggiuntivo e affronta il problema della contaminazione nell’incubatore^7,9,11,12. Inoltre, lo strumento di grandi dimensioni non può dare un ambiente di controllo preciso di fornire elevata riproducibilit๳.

Considerando che carichi di cella idrogeli sono in genere impiegati su micro-scala per applicazioni biomediche, è vantaggioso per combinare le tecniche MEMS per generare una gamma di stimolazione di ceppo/tratto contemporaneamente studiare i comportamenti delle cellule in 3D biomimetici costrutti in vitro^{2,14,15,16,17,18}. Ad esempio, utilizzando la pressione del gas per deformare la membrana PDMS in chip microfluidici possa dar luogo a vari ceppi, guidando la differenziazione delle cellule a diversi lignaggi^9,16. Tuttavia, ci sono molte sfide tecniche, quali i processi di fabbricazione di complicati chip in una camera pulita e il software di integrazione di controllo dei motori, pompe, valvole e gas compressi.

In questo lavoro, dimostriamo un approccio semplice per ottenere un chip di gradiente statico-ceppo microfluidici autosufficiente con l’ausilio di un modello di idrogel circolari concentrici e una membrana flessibile di PDMS. Diversamente dalla maggior parte degli approcci esistenti, la nostra piattaforma è un dispositivo portatile e USA e getta in miniatura che può essere fabbricato fuori una camera gialla e che possiede auto-generazione di gradienti ceppi su concentrici idrogeli incapsulato in cella, senza attrezzature meccaniche esterne durante l’incubazione. Comportamenti di cellulare dei fibroblasti 3T3 influenzata da una combinazione di forma idrogel e una varietà di segnali di orientamento elasticizzato trazione sono stati dimostrati durante l’osservazione di allineamento della cella all’interno di ambienti 3D ECM-mimetici nel chip gradiente di deformazione per 3 giorni.

Protocol

1. GelMA Synthesis Weigh 10 g of gelatin powder and add it to a glass flask with 100 mL ofDulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS). Put a magnetic stir bar into the flask and place the flask on a stirring hot plate. Cover the flask with aluminum foil to avoid water evaporation. Set the hot plate temperature to 50-60 °C and the stirrer at 100 rpm for 1 h to dissolve the gelatin powder well. After the gelatin has dissolved, add 8 mL of methacrylic anhydride very slowly (one drop …

Representative Results

Per confrontare le variazioni meccaniche tra ogni idrogel circolare nel chip stimolazione ceppo gradiente completato, abbiamo misurato la larghezza di riga di ogni idrogel circolare in due i chip stesso, con volumi di iniezione di 0 µ l (Figura 4a) e 40 µ l (Figura 4b), rispettivamente. Il percentuali allungamenti al ogni cerchio sono stati calcolati dividendo gli allungamenti nel chip 40 µ l-iniettato per la larghezza di riga…

Discussion

In questa carta, segnaliamo su un approccio semplice per confrontare il comportamento di allineamento delle cellule dopo idrogel forma di orientamento e di allungamento a trazione. Una membrana flessibile di PDMS crea una curvatura a forma di cupola per la generazione di diverse altezze di idrogeli circolari concentrici. Dopo aver rilasciato la pressione, la membrana PDMS applica automaticamente la forza per il micro-fantasia idrogeli per formare gradiente ceppo/allungamento, con un massimo al centro e un minimo al confi…

Materials

1.5-mL black microcentrifuge tube	Argos Technologies	03-391-161	This one can be replaced with a neutral color of 1.5-mL tube covered with aluminun foil
10X DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379
BSA	Sigma	A1595
Calcein	Molecular Probe	C1430	For labeling viable cells
CCD	PCO. Imaging	Pixelfly qe
Cell membrane permeating solution	Sigma-Aldrich	X100	0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Cell nucleus staining
Dialysis membrane	Sigma-Aldrich	D9527	Molecular weight cut-off = 14,000
DMEM	Gibco	11995-065
Double-side tape	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500	gel strength 300, type A, from porcine skin
High frequency electronic corona generator	Electro-technic products	MODEL BD-20
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685
Micro syringe	Hamilton	80501	50 μL
Microscope	Olympus	IX71	Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock
Oxygen plasma machine	Harrick plasma	PDC-001
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	For fixing cell
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication
Pen-Strep	Gibco	10378-016	penicillin/streptomycin
Photoinitiator	CIBA	Irgacure 2959
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170	For labeling dead cells
Sterile Filtration cup	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	For hydrogel immobilization
Ultrasonicator	Delta	D150H	150W, 43kHz
UV light	DAIHAN	WUV-L10
Freeze Dryer	FIRSTEK	150311025
NIH3T3(fibroblast)	Food Industry Research and Development Institute(FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini Automated Cell Counter	ORFLO	MXZ001