Gradient belastning Chip for stimulerende cellulære atferd i celle-laden Hydrogel

Summary

Denne artikkelen presenterer en enkel tilnærming til å gi ikke-sammenhengende gradient statisk påkjenningene på en konsentrisk celle-laden hydrogel å regulere cellejustering tissue engineering.

Abstract

Kunstig veiledning for mobilnettet justering er et hett tema innen tissue engineering. De fleste av de tidligere forskningen har undersøkt enkelt press-indusert mobilnettet justering på en celle-laden hydrogel med komplekse eksperimentelle prosesser og masse kontrollere systemer, som er vanligvis tilknyttet forurensning problemer. Derfor, i denne artikkelen foreslår vi en enkel tilnærming til å bygge en gradient statisk belastning bruker en fluidic chip med en plast PDMS cover og en UV gjennomsiktig barometer substrate for stimulering av mobilnettet atferd i en 3D hydrogel. Overbelasning bilde-patternable celle prepolymer i det fluidic kammeret kan generere en konveks buede PDMS membran på forsiden. Etter UV crosslinking, gjennom en konsentrisk sirkulære micropattern under den buede PDMS membran, og buffer vaskemaskin, en microenvironment for undersøke celle atferd under en rekke gradient stammer er selv etablert i én enkelt fluidic brikke, uten eksterne virkemidler. NIH3T3 celler ble vist etter å observere endringen i mobilnettet justering trenden under geometri veiledning, i samarbeid med belastning stimulering, som varierte fra 15-65% på hydrogels. Etter en 3-dagers inkubasjon dominert hydrogel geometrien cellejustering under lav kompresjons belastning, der cellene justeres hydrogel forlengelse retning under høy kompresjons press. Mellom disse cellene viste tilfeldig justering på grunn av spredning av radikale veiledning av hydrogel forlengelse og geometri veiledning av mønstret hydrogel.

Introduction

Tjene som en blokk materiale som etterligner en innfødt microenvironment, kan en hydrogel inneholder ekstracellulær matrix (EFM) re bygge biomimetic vev stillaser for å støtte cellevekst. For å ha en vev funksjoner, er organisert cellejustering en viktig forutsetning. Ulike 2D (dvs. celler kultivert på en overflate) og 3D (dvs. celler innkapslet i en hydrogel) cellejustering oppnådd av dyrking eller innkapsle celler i eller på fleksible underlag med micro- eller nano-mønstre¹. 3D cellejustering i mikroarkitektur er mer attraktiv som microenvironment er nærmere innfødt vev konstruere^2,3,4. En felles tilnærming for 3D cellejustering er geometriske stikkordet hydrogel figur^2,3. På grunn av begrenset plass til celle spredning i kort-aksen retning, celler som mål å justere lang-aksen retning i en mikro-mønstret hydrogel. En annen tilnærming er å bruke strekk strekker hydrogels å oppnå cellejustering parallell til strekk retning^4,5.

Biofysiske stimulering på ECM hydrogels, for eksempel kompresjons belastning eller et elektrisk felt, kan regulere celle funksjoner for riktig vev integrasjon, spredning og differensiering^1,2,3. Mye forskning har blitt gjort for å undersøke mobilnettet atferd ved å bruke en belastning betingelse samtidig bruker flere mekanisk styring enheter^4,6,7,8,9. For eksempel bruk av mekaniske trinn motorer klemmet eller strukket på en 3D celle-innkapslet kollagen hydrogel er en felles tilnærming^7,10. Men slik kontrollerer utstyr krever ekstra plass og står overfor spørsmålet om forurensning i inkubator^7,9,11,12. I tillegg gi store apparatet ikke et nøyaktig kontrollmiljø å gi høy reproduserbarhet¹³.

Tatt i betraktning at celle-laden hydrogels er vanligvis ansatt på mikro-skala for biomedisinsk programmer, er det fordelaktig å kombinere MEMS teknikker for å generere en rekke belastning/stretch stimulering samtidig undersøke celle atferd i 3D biomimetic konstruksjoner i vitro^{2,14,15,16,17,18}. For eksempel kan bruker gasstrykket for å deformere PDMS membran microfluidic sjetonger gi opphav til ulike belastninger, kjører celledifferensiering til forskjellige overleveringslinjer^9,16. Men er det mange tekniske utfordringer, for eksempel komplisert flis fabrikasjon prosesser i et rent rom og programvare kontroll integrering av motorer, pumper, ventiler og komprimerte gasser.

I dette arbeidet viser vi en enkel tilnærming for å få en selvdrevet gradient statisk-belastning microfluidic chip ved å bruke et konsentrisk sirkulære hydrogel mønster og en fleksibel PDMS membran. I motsetning til de fleste av de eksisterende metodene er vår plattform en bærbar og disponibel miniatyr enhet som kan fremstille utenfor en gul rommet og som besitter selv generere gradient påkjenningene på konsentriske celle-kapslet hydrogels, uten eksterne mekanisk utstyr under incubation. 3T3 fibroblast celle atferd påvirket av en kombinasjon av hydrogel form og en rekke strekk strekk veiledning signaler ble vist under observasjon av cellejustering i 3D ECM-mimetic miljøer i gradient belastning chip for 3 dager.

Protocol

1. GelMA Synthesis Weigh 10 g of gelatin powder and add it to a glass flask with 100 mL ofDulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS). Put a magnetic stir bar into the flask and place the flask on a stirring hot plate. Cover the flask with aluminum foil to avoid water evaporation. Set the hot plate temperature to 50-60 °C and the stirrer at 100 rpm for 1 h to dissolve the gelatin powder well. After the gelatin has dissolved, add 8 mL of methacrylic anhydride very slowly (one drop …

Representative Results

For å sammenligne de mekaniske variasjonene mellom hver runde hydrogel i fullført gradient belastning stimulering chip, målt vi linje bredden på hver runde hydrogel i to av samme chips, med injeksjon mengder 0 µL (figur 4a) og 40 µL (figur 4b), henholdsvis. De prosent videreutvikling på hver sirkel ble beregnet ved å dele videreutvikling i 40 µL-injisert chip linje bredden på den tilsvarende hydrogels i 0 µL-injisert b…

Discussion

I dette papiret rapportere vi om en enkel tilnærming til å sammenligne celle justeringsalternativer etter hydrogel figur veiledning og strekk strekker. En fleksibel PDMS membran oppretter en kuppel-formet kurvatur for å generere ulike høyder av konsentrisk sirkulære hydrogels. Etter slippe presset, gjelder PDMS membranen automatisk kraft mikro-mønstret hydrogels til gradient belastning/elongation, med et maksimum på center og minimum på den ytre grensen. Som dannelsen av gradient belastningen er designet av fleks…

Materials

1.5-mL black microcentrifuge tube	Argos Technologies	03-391-161	This one can be replaced with a neutral color of 1.5-mL tube covered with aluminun foil
10X DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379
BSA	Sigma	A1595
Calcein	Molecular Probe	C1430	For labeling viable cells
CCD	PCO. Imaging	Pixelfly qe
Cell membrane permeating solution	Sigma-Aldrich	X100	0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Cell nucleus staining
Dialysis membrane	Sigma-Aldrich	D9527	Molecular weight cut-off = 14,000
DMEM	Gibco	11995-065
Double-side tape	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500	gel strength 300, type A, from porcine skin
High frequency electronic corona generator	Electro-technic products	MODEL BD-20
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685
Micro syringe	Hamilton	80501	50 μL
Microscope	Olympus	IX71	Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock
Oxygen plasma machine	Harrick plasma	PDC-001
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	For fixing cell
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication
Pen-Strep	Gibco	10378-016	penicillin/streptomycin
Photoinitiator	CIBA	Irgacure 2959
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170	For labeling dead cells
Sterile Filtration cup	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	For hydrogel immobilization
Ultrasonicator	Delta	D150H	150W, 43kHz
UV light	DAIHAN	WUV-L10
Freeze Dryer	FIRSTEK	150311025
NIH3T3(fibroblast)	Food Industry Research and Development Institute(FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini Automated Cell Counter	ORFLO	MXZ001