Градиент штамм чип для стимулирования клеточных поведения в ячейке Ладена Гидрогель

Summary

Эта статья знакомит простой подход к обеспечению непостоянного градиента статические штаммов на концентрические клеток Ладена гидрогеля регулировать выравнивание ячеек для тканевой инженерии.

Abstract

Искусственные руководство для сотовых выравнивание является горячей темой в области тканевой инженерии. Большинство предыдущих исследований провела расследование одного штамма индуцированной сотовой выравнивание на клетки Ладена гидрогеля с помощью сложных процессов экспериментальных и массового управления системами, которые обычно связаны с вопросами загрязнения. Таким образом в этой статье, мы предлагаем простой подход к построению градиента статической деформации, с использованием оптимизированных чип с пластиковой крышкой PDMS и УФ прозрачной стеклянной подложке для стимуляции клеточного поведения в 3D гидрогеля. Перегрузка форполимера фото patternable клеток в зале аэрогидродинамических может генерировать выпуклой кривой PDMS мембраны на обложке. После УФ сшивки через концентрические круговые микроузор под изогнутой PDMS мембраны и буфера мытья, микроокружение для расследования ячейки поведения при различных штаммов градиента самостоятельно созданной в оптимизированных микросхема, без внешних инструментов. NIH3T3 клетки были продемонстрированы после наблюдения изменений в клеточных выравнивание тенденции под руководством геометрии, в сотрудничестве с штамм стимуляции, которая колебалась от 15-65% на гидрогели. После 3 дней инкубации гидрогеля геометрии доминировали выравнивание ячеек в низкой сжимающие напряжения, где клетки выстраиваются вдоль оси удлинения гидрогеля под высоким Сжимающее напряжение. Между этими клетки показали случайных выравнивания из-за рассеивания радикальной руководство гидрогеля удлинение и геометрии руководством узорной гидрогеля.

Introduction

Качестве блок материала, который имитирует родной микроокружения, гидрогеля, содержащий внеклеточного матрикса (ECM) можно заново строить biomimetic ткани подмости для поддержки роста клеток. Обладать функции ткани, выравнивание организованные ячейки является важным требованием. Различные 2D (т.е. клетки культивировали на поверхности) и 3D (т.е. клетки, инкапсулированные в Гидрогель) рядов клеток были достигнуты путем культивирования или инкапсуляции клетки в или на гибких подложках с микро- или нано структуры¹. Выравнивание ячейки 3D в микроархитектуре более привлекательной, как микроокружения ближе к родной ткани построить^2,3,4. Один общий подход для выравнивания 3D клеток — геометрические подсказка гидрогеля форма^2,3. Из-за ограниченного пространства для пролиферации клеток в короткой оси клетки цель для выравнивания вдоль Лонг-оси в микро узорные гидрогеля. Другой подход заключается в том, чтобы применить растяжение растяжение к гидрогели для достижения выравнивание ячейки параллельно стрейч направление^4,5.

Биофизические стимуляции на ECM гидрогели, такие сжимающие напряжения или электрического поля, можно регулировать функции клеток для надлежащего ткани интеграции, распространение и дифференциации^1,2,3. Много исследований было сделано для расследования сотовой поведение, применив один из деформированного состояния на время, используя несколько механического управления подразделения^4,6,,78,9. Например использование механического шаговые двигатели сжал или растягивается на 3D инкапсулированных клеток коллагена гидрогеля был общий подход^7,10. Однако такого контрольного оборудования требуется дополнительное пространство и сталкивается с проблемой загрязнения в инкубатор^7,9,,1112. Кроме того большой инструмент не может дать точного управления окружающей среды обеспечить высокую воспроизводимость¹³.

Учитывая, что клетки Ладена гидрогели, как правило, работают на микро масштабе для биомедицинских приложений, это выгодно совместить MEMS технологии для создания целого ряда штамм/стрейч стимуляции одновременно расследовать поведение ячейки в 3D biomimetic конструкции в пробирке^{2,14,,1516,17,18}. Например используя давление газа деформировать PDMS мембраны microfluidic фишек может привести к различных штаммов, вождение дифференцировки клеток различных линий^9,16. Однако есть много технических проблем, таких, как процессы изготовления сложных чип в чистой комнате и интеграции программного обеспечения управления двигателей, насосов, клапанов и сжатых газов.

В этой работе мы демонстрируем простой подход для получения самоподдерживающегося градиента статическое напряжение microfluidic чип, используя шаблон концентрические круговые гидрогеля и гибкие PDMS мембраны. В отличие от большинства существующих подходов Наша платформа является портативным и одноразовые миниатюрное устройство, которое могут быть изготовлены за пределами желтой комнате и который обладает собственной генерации градиента штаммов на концентрические инкапсулированные клетки гидрогели, без внешнего механического оборудования во время инкубации. Поведение клеток фиброцита 3T3 под влиянием сочетания формы гидрогеля и различные растяжение стрейч указания подсказки были продемонстрированы в ходе наблюдения за выравнивание ячеек внутри 3D ECM-подражательный сред в чипе градиента напряжения для 3 дней.

Protocol

1. GelMA Synthesis Weigh 10 g of gelatin powder and add it to a glass flask with 100 mL ofDulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS). Put a magnetic stir bar into the flask and place the flask on a stirring hot plate. Cover the flask with aluminum foil to avoid water evaporation. Set the hot plate temperature to 50-60 °C and the stirrer at 100 rpm for 1 h to dissolve the gelatin powder well. After the gelatin has dissolved, add 8 mL of methacrylic anhydride very slowly (one drop …

Representative Results

Чтобы сравнить механические различия между каждой круговой гидрогеля на чипе стимуляции завершенных градиента напряжения, мы измерили ширину линии каждого круговой Гидрогель в двух же фишки, с объемами впрыска 0 мкл (рис. 4a) и 40 мкл (рис. 4b</stro…

Discussion

В этой статье мы сообщаем о простой подход для сравнения характеристик выравнивания ячеек после гидрогеля форма руководства и растяжение растяжение. Гибкие PDMS мембраны создает куполообразная кривизны для генерации различных высот концентрические круговые гидрогелей. После выпуска ?…

Materials

1.5-mL black microcentrifuge tube	Argos Technologies	03-391-161	This one can be replaced with a neutral color of 1.5-mL tube covered with aluminun foil
10X DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379
BSA	Sigma	A1595
Calcein	Molecular Probe	C1430	For labeling viable cells
CCD	PCO. Imaging	Pixelfly qe
Cell membrane permeating solution	Sigma-Aldrich	X100	0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Cell nucleus staining
Dialysis membrane	Sigma-Aldrich	D9527	Molecular weight cut-off = 14,000
DMEM	Gibco	11995-065
Double-side tape	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500	gel strength 300, type A, from porcine skin
High frequency electronic corona generator	Electro-technic products	MODEL BD-20
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685
Micro syringe	Hamilton	80501	50 μL
Microscope	Olympus	IX71	Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock
Oxygen plasma machine	Harrick plasma	PDC-001
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	For fixing cell
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication
Pen-Strep	Gibco	10378-016	penicillin/streptomycin
Photoinitiator	CIBA	Irgacure 2959
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170	For labeling dead cells
Sterile Filtration cup	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	For hydrogel immobilization
Ultrasonicator	Delta	D150H	150W, 43kHz
UV light	DAIHAN	WUV-L10
Freeze Dryer	FIRSTEK	150311025
NIH3T3(fibroblast)	Food Industry Research and Development Institute(FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini Automated Cell Counter	ORFLO	MXZ001