Nous décrivons ici une procédure permettant une analyse détaillée de l’activation dépendante de la phosphorylation du facteur de transcription IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps phosphospécifiques.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le facteur de transcription IRF3 est essentiel pour la première ligne de défense contre les agents pathogènes, principalement par le biais de l’interféron β et de l’expression des gènes antiviraux. Une analyse détaillée de l’activation d’IRF3 est essentielle pour comprendre comment les agents pathogènes induisent ou échappent à la réponse antivirale innée. Des formes activées distinctes d’IRF3 peuvent être distinguées en fonction de leur phosphorylation et de leur statut monomère vs dimère. La discrimination in vivo entre les différentes espèces activées d’IRF3 peut être réalisée par la séparation des formes phosphorylées d’IRF3 en fonction de leurs déplacements de mobilité sur SDS-PAGE. De plus, les niveaux de monomères et de dimères IRF3 peuvent être surveillés à l’aide d’une électrophorèse non dénaturante. Ici, nous détaillons une procédure pour atteindre la résolution la plus élevée afin d’obtenir le plus d’informations concernant l’état d’activation de l’IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps totaux et phosphospécifiques. Cette stratégie expérimentale constitue une approche abordable et sensible pour acquérir toutes les informations nécessaires à une analyse complète de l’activation d’IRF3 par la phosphorylation.
Introduction
Le facteur de transcription ubiquitaire et exprimé de façon constitutive interféron (IFN) Facteur de réglementation 3 (IRF3) est crucial pour la première ligne de défense contre les agents pathogènes principalement par l'induction d'IFNß, mais aussi grâce à l'induction de la chimiokine (CC motif) ligand 5 (CCL5 ) et de plusieurs protéines, y compris la protéine antivirale de l'IFN-induite avec tétratricopeptide répète IFIT1 / 2/3 de 1-3. Activation de IRF3 a été rapporté ci-après infection avec de nombreux virus, ou l'exposition à l'acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou un lipopolysaccharide (LPS) 4. S....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
REMARQUE: Le protocole est décrit ici en utilisant des cellules A549 infectées avec le virus Sendai (SeV). Toutefois, le protocole de SDS-PAGE et PAGE natif travaille également avec tous les types humains et murins cellulaires testées jusqu'à présent, en particulier les cellules myéloïdes stimulées par divers stimuli 9,15,19,24,25 IRF3 activation.
1. L'infection de cellules A549
- Maintenir cellules A549 en culture dans une plaque de 15 cm à 37 ° C / 5% CO 2 dans 20 ml F12K moyen / Ham contenant 10% de sérum inactivé par la chaleur de veau fœtal (HI-FBS) et 1% de L-glutamine (F12K complet / moyen Ham....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La figure 2 montre une image typique de immunoblot IRF3 détecté avec IRF3 anticorps totaux et des anticorps IRF3-phosphospécifiques contre Ser396 et Ser398 après la résolution de WCE par haute résolution SDS-PAGE. Dans les cellules non stimulées A549, IRF3 est détecté comme deux bandes à 50 et 53 kDa sur SDS-PAGE correspondant à la non-phosphorylée (formulaire I) et le hypophosphorylé (forme II) espèces de IRF3. L'exposition des cellules A549 au SEV pour les 3 - 9 ré.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Le protocole que nous décrivons ici se compose d'une combinaison de haute résolution SDS-PAGE et PAGE natif couplé à l'utilisation de plusieurs anticorps phosphospécifiques à distinguer le monomère / dimère et phosphoforms I-IV de IRF3. Détection approprié de ces espèces IRF3 est essentiel pour caractériser complètement l'activation de IRF3 dans un contexte spécifique. Par exemple, LPS stimulation de macrophages activés conduit à la formation de dimères, Ser396 / 398 IRF3 phosphorylée qui présente une hypoph.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs remercient les membres précédents et actuels du laboratoire pour le développement des protocoles. Les travaux ont été financés par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) [subvention # MOP-130527] et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada [CRSNG-355306-2012]. NG est récipiendaire d’une chaire de recherche du Canada de niveau II. AR est titulaire d’une bourse d’études du programme de formation du Réseau de recherche en santé respiratoire du Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Chaud dans un 37 ° ; C avant utilisation. |
| Sérum fœtal bovin | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Pour la culture cellulaire. |
| Trypsine/EDTA 0,25 | %Life Technologies | 25200-072 | |
| Virus de Sendai Souche Charles | River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycérol | Bioshop | GLY001.1 | Coupez l’extrémité de la pointe et pipetez lentement car elle est très épaisse. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Marque déposée correspondant à Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) détergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 ; | |
| Fluorure de sodium | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Orthovanadate de sodium | MP Biomedicals | 159664 | Activation de l’orthovanadate de sodium 0,2 M : 1) Ajuster le pH à 10,0 en utilisant soit 1 N NaOH, soit 1 N HCl. Le pH de départ de la solution d’orthotovanadate de sodium peut varier avec beaucoup de produit chimique. 2) La solution est jaune à pH 10,0. 3) Faire bouillir jusqu’à ce qu’il soit incolore. 5) Ajustez le pH à 10,0 et répétez les étapes 3 et 4 jusqu’à ce que la solution reste incolore et se stabilise à 10,0. Stocker les aliquotes d’orthovanadate de sodium activé à -20 °C. |
| phosphate de p-nitrophényle sel disodique hexahydraté | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Bêta-glycérophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 ; | |
| Réactif de dosage des protéines Bio-Rad ; | Bio-Rad | 500-0006 ; | cytotoxique |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 ; | cytotoxique |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Acide chlorhydrique (HCl) | LabChem | LC15320-4 ; | Travailler sous hotte. Toxique et irritant. |
| Dodécylsulfate de sodium (SDS) | Bioshop | SDS001.1 ; | irritant. |
| Persulfate d’ammonium | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxique et irritant. |
| Bleu de bromophénol | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Bêta-mercaptoéthanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Fonctionne sous hotte. Toxique pour le système nerveux, les muqueuses. Peut être toxique pour les voies respiratoires supérieures, les yeux, le système nerveux central. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Désoxycholate de sodium | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Hydroxyde de sodium (NaOH) | Bioshop | SHY700 ; | irritant. |
| Membrane nitrocellulosique (0,45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acide acétique glacial | Bioshop | ACE222.4 | Travail sous hotte. Toxique, irritant et inflammable. |
| Ponceau rouge | Sigma-Aldrich | P3504 ; ; | |
| Chlorure de potassium (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 ; | Pour la composition PBS pour immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | Pour une composition PBS pour immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 ; | Pour la composition PBS pour immunoblot. |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A7906 | Pour la composition de PBS-T-BSA pour immunoblot. |
| Lait écrémé en poudre | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Coupez l’extrémité de la pointe et pipetez lentement car elle est très épaisse. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Stocker aliquote à -20 oC. Eviter le gel/dégel. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Fait maison19 | Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Technologie de signalisation cellulaire | 4947s | Stocker à -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Fait maison15 | Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel. | |
| Anti-IRF-3-full-length | Actif motif | 39033 | Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Magasin aliquote à -20 oC. |
| Western Lightning Réactif de chimiluminescence Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini Appareil de caméra CCD | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Normes de poids moléculaire, large gamme | Bio-Rad | 161-0317 | Magasin aliquote à -20 oC. |
Références
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
