En insprutningssystem för att undersöka neurofarmakologi of Information Processing i Vakna uppför Macaque Monkey Cortex

Summary

Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.

Abstract

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.

Introduction

In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine¹. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies², as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals³ and systemic pharmacological manipulations in humans⁴. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems^5,6 and can lead to changes in neural activity³.

Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug⁷. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules⁸, correlating with the tip diameter⁹ of the micropipette as well as with the concentration⁸ of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used¹⁰, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.

Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley¹¹ for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain¹²) to a defined brain area¹³ while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette¹³. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly¹⁴ and intracellularly^15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see¹⁷ for a comparison of recent pressure injection systems).

An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.

The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.

Protocol

Djuromsorg och alla experimentella procedurer genomfördes i enlighet med den tyska lagstiftning som reglerar djurvård och godkännas av distriktet regeringen i Braunschweig, Niedersachsen, Tyskland. OBS: Eftersom experimentet utförs in vivo, är det viktigt att hålla högsta möjliga hygienstandard. När det är möjligt, arbeta under sterila förhållanden. 1. Förbered injektionen / Recording System Sterilisera röret som förbinder mikropipett med sprutan. Använd den kortaste längden av röret möjligt i experimentuppställningen mellan insprutningspumpen och elektrofysiologiska registreringssystem. Rengör styrrören i registreringssystemet med hjälp av rengöringstrådar. Doppa dem i sterila silikonolja och mata dem genom de enskilda styrrören flera gånger. Sätt i kvartsglaset mikropipett in i ett styrrör hos registreringssystemet. Se figur 1A. Efter fastställande av mikropipett iregistreringssystemet, bifoga sterilt rör till metallstift mikropipett. Ta hand om dig; trots mikropipett är fäst i systemet kan det lätt gå sönder när du sätter röret. Använd två sterila pincett för att tillämpa samma tryck på stiftet och röret. Använd flytande superlim för att täta förbindelsen mellan röret och mikropipett. Vänta minst tre timmar för limmet att härda innan du fyller mikropipett med vätska. Sätt microelectrodes (t.ex. kvartsglas isolerad platina volfram) i de andra positionerna hos registreringssystemet före eller efter mikropipett insättning. 2. Förbered ämnet Sterilisera 1,5 ml mikrocentrifugrör för senare lagring av injektionslösningar med hjälp av en autoklav eller annan pålitlig förfarande. Väg motsvarande ämnet skopolamin hydroklorid för att förbereda 5 ml av en 0,1 molar lösning. Lös upp i steril saltlösning (0,9% NaCl). Under sterila betingelser ina dragskåp, filtrera lösningen med hjälp av en spruta filter med tillräckligt stor pordiameter, t.ex. 0,2 pm. Under dragskåp, alikvot av lösningen i volymer som är tillräckliga för ett enda experiment, t.ex., för skopolamin, 500 pl i sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Använd mörka rör för att skydda ämnet från ljus; alternativt linda rör i aluminiumfolie. För skopolamin, lagra lösningen i upp till 14 dagar vid 4 ° C. 3. Daglig Beredning av Injection / Recording System Obs: Vid montering i registreringssystemet, är elektroderna och mikropipett lagras i en enzymlösning (Tergazyme, 1% lösning med avjoniserat vatten) mellan inspelningar. Följande steg måste utföras före varje inspelning. Samla in ett rör av den substans som skall injiceras. Låt det nå RT om kyld. Ta injektionen / registreringssystemet från enzymlösningen och skölj elektroderoch mikropipett med avjoniserat vatten för att rengöra helt enzymlösning. Ta bort frontkåpan av registreringssystemet för att visuellt kontrollera tätningen mellan mikropipett och rör. Tillämpa steril silikonolja till gapet styrröret (se fig 1A) och spetsarna hos elektroderna och mikropipett för att smörja systemet för mjuk rörelse. Kontrollera tips av elektroder och mikropipett med hjälp av ett mikroskop för att säkerställa att de är intakta. Rikta in elektroder och mikropipett under mikroskop, så att de sträcker sig ut ur styrrören med samma längd. Driva dem in i styrrören, stoppa så snart de inte längre är synliga. Detta definieras som elektrod läge noll. Ställa in djupet för elektroderna och mikropipett till 0 i programvaran. Fyll en steril spruta med steril saltlösning och stick in nålen i röret, noga med att inte tränga igenom rörväggen. Kör mikropipett ut ur styrröret för visual kontroll av substansflöde. Flush minst 2 ml steril saltlösning genom röret och mikropipett för att säkerställa att ingen luft finns kvar i sprutan eller i röret. Applicera inte för mycket tryck på sprutkolven. Säkerställa förbindelsen mellan röret och mikropipett är förseglad. Om läckaget är synlig, åter limma korsningen (se steg 1,5) och skjuta inspelning. Fyll en ny steril spruta med den lösning som skall injiceras och utbyta den med fat av saltlösning spruta, dvs. att hålla nålen i saltlösningsfylld spruta i röret. Se till att ingen luft överförs in i systemet. Detta uppnås bäst genom att fylla nålnavet med koksaltlösning efter avlägsnande av saltlösningsfylld fat. Spola systemet med 250 | il av den lösning som skall injiceras, i syfte att helt ta bort saltlösning från röret. Använda motorstyrprogram, dra elektroder och mikropipett i guidetubesto ett djup av åtminstone -500 um. <li> Sänk styrröret ringen (Figur 1A) till botten av styrrören för att bibehålla sin fasta relativa positionen. Rengör basen av systemet med etanol, i synnerhet när det kommer att beröra apans inspelningen kammaren. Stäng registreringssystemet genom att ersätta den främre luckan och dra åt skruvarna. 4. Validering av insprutningssystemet Notera: Även om företaget kalibrerar systemet, är det rekommenderat att validera de utstötta volymer med de material som används i den experimentella uppställningen (rör, sprutor etc.). Förbereda systemet såsom beskrivs i steg 3, att hålla elektroderna och mikropipett utsträckta ut ur styrrören. Ett djup av minst 7000 ^ m rekommenderas för att undvika förlust av mätvolymen på grund av vidhäftning längs den yttre ytan av mikropipett och elektroderna. Placera registreringssystemet i det läge den kommer att användas i under experimentet och sätta SyrinGE in i mikroinjektion pumpen. Fäst sprutan på plats med hjälp av gummiband och justerbar grepp (se figur 1A). Skjut den rörliga delen av pumpen tills den är ordentligt på plats bakom sprutkolven. Med hjälp av mjukvarustyrd motorenhet, mata ut en volym tillräckligt stor för att mätas exakt, t ex., 1000 nl. Det är föredraget att använda ett enda steg för att mata ut den totala volymen för att undvika effekterna av kapillärverkan längs mikropipett ytan. Mycket låga hastigheter (1 nl / s) kan också leda till denna effekt under valideringsförfarande. Samla den totala volymen i en behållare placerad under mikropipett eller försiktigt samla utkastade släppa direkt från spetsen av mikropipetten. Uppskatta utkastade volymen med hjälp av en pipett eller genom vägning med en precisionsskala. Upprepa proceduren flera gånger för att bekräfta mätningar. 5. Akuta Record Ställa in xy-positionenav registreringssystemet. Detta definierar den punkt där styrrören nå dura mater inom kroniskt implanterade inspelningen kammaren. Se till att styrrören dras tillbaka helt (styrröret z position 0). Bringa registreringssystemet i läge och placera sprutan i mikroinjektion pumpen. Fäst sprutan på plats med hjälp av gummiband och justerbar grepp (se figur 1A). Skjut den rörliga delen av pumpen tills den är ordentligt på plats bakom sprutkolven. Om en droppe ämne syns på spetsen av styrrören försiktigt bort den med hjälp av en steril bomullspinne. Förbered djuret för inspelning enligt laboratoriets förfarande (se 18 till exempel riktlinjer). Säkert montera registreringssystemet på inspelningen kammaren av apan. Långsamt manuellt sänka styrrören i inspelningen kammaren tills dura nås, sedan köra elektroderna med hjälp av motor control programvara. Eftersom det inte är möjligt att mäta impedansen hos mikropipett, först köra med elektroder och kontrollera deras impedanser regelbundet på olika djup. Efter en genomträngning av dura utförs med framgång utan att skada elektroderna, förväg mikropipetten. Kör elektroderna och mikropipett till målet elektrod djup på vilket hjärnan intresseområde förväntas hittas. Sakta föra elektroden tills det är tillräckligt nära för att registrera aktiviteten av en enda enhet, vilket framgår av en bra signal-brusförhållande i den inspelade signalen. Viktigare, placera inspelningen elektroden och mikropipett vid samma djup för att säkerställa det minsta avståndet mellan elektroden och mikropipett. Om möjligt, hålla elektroderna och mikropipett på detta djup för hela inspelningen. Men om det enda sättet att bibehålla signalkvaliteten hos den inspelade cellen är att flytta elektroderna, sedan köra elektroderna och mikropipettensamtidigt för att bibehålla avståndet mellan dem. 6. Spatial Attention Task I en serie försök, nuvarande två rörliga punktmönster på skärmen, en placerad inom receptiva fält av den inspelade neuron och den andra utanför den, tillsammans med en centralt presenterade fixeringspunkt att djuret måste foveate under varje försök 19, 20. Obs: Apan är tränad att svara på en riktningsändring i cued punktmönster (målet händelsen) och bortse från vilken riktning som helst förändring i den andra punktmönster, och belönas med en vätskedroppe för varje framgångsrikt slutförande av en rättegång 19, 20. Som en sensorisk kontroll skick, har apan att rapportera en luminans förändring av fixeringspunkt och bortse från de båda rörliga punktmönster (se figur 2 för en mer detaljerad beskrivning av uppgiften). 7. Farmakologisk manipulation medan inspelningen <p> OBS: Medan apan utför uppgiften, injicera substansen i ett blockvis sätt. Tre på varandra följande block definieras: kontroll, som verkar som en baslinje; injektion, under vilken ett ämne matas ut; och återhämtning, under vilken cellerna riktade genom injektion återgång till baslinjen. Under en injektion blocket, injicera en fördefinierad mängd av ämnet med jämna mellanrum eg., 2 nl varje minut med en hastighet av 2 Nl / s. I det här exemplet använder skopolamin hydroklorid. Insprutningsprocessen styrs med hjälp av programvara som ger olika alternativ. Till exempel använder funktionen steg för att definiera injektionsvolym och tryck på injektionsknappen varje minut enligt klocka inspelningsprogrammet. Obs: Den exakta varaktigheten av insprutningsblocket är substans och experimentera beroende, till exempel, för skopolamin användning 2 NL injektioner per minut under 10 minuter (20 nl totalt).. Det är bättre att inte avancera elektroderna och mikropipett During injektionskammaren. Notera tiden och försöket under vilken substansen sprutas, djupet av elektroderna och mikropipett, såväl som mängden utkastade substans. Följ injektionsblocket med en återhämtning block där ingen substans injiceras. Varaktigheten av återvinningsblocket är ämnesspecifik och måste definieras i förtester. Övervaka och underhålla inspelningskvalitet av de utvalda enskilda enheter fram till slutet av återvinningsblocket. Upprepa tre blocken så länge inspelningskvalitet och motivation apan tillåter. 8. Post Inspelnings Förfaranden Efter datainsamling, dra tillbaka elektroderna och mikropipett i styrrören och sedan manuellt dra styrrören. Ta bort registreringssystemet från inspelningen kammare apan. Släpp sprutan från insprutningspumpen och överföra systemet till förberedelse område för rengöring. Hantera djur(inklusive rengöring av inspelningen kammaren 18) i enlighet med standardprocedurer i laboratoriet och returnera den till bostäder anläggning. Skölj utsidan av styrrören med väteperoxid (3%) och därefter med avjoniserat vatten. Drivelektroder och mikropipett ut ur styrrören, skölj med väteperoxid och därefter avjoniserat vatten. Byta ut sprutans cylinder med en pipa av en spruta fylld med steril koksaltlösning, hålla nålen i röret. Spola röret och mikropipett med 1-2 ml av saltlösning. Efter spolning, ta bort pipan och fylla den med luft. Sätt tillbaka pipan in i nålen och torka röret och mikropipett från insidan genom att försiktigt trycka luft genom. Lagra styrrören, utökade elektroder och mikropipett nedsänkta i enzymlösningen för att undvika uttorkning samt att säkerställa nedbrytning av organiskt material.

Representative Results

Figur 2 avbildar den rumsliga uppmärksamhet uppgiften apan utförs medan insprutningsprocessen genomfördes. Apan var utbildad att sköta antingen stimulus belägen inom receptiva fält av den inspelade neuron (delta-in), den stimulans som ligger utanför den receptiva fält (delta-out) eller fixeringspunkt (delta-fix). Dessa villkor tillåter en jämförelse av neuronal aktivitet i olika uppmärksamhetstillstånd. Figur 3 visar ett peri-stimulus tids histogram av ett prov neuron i ett experiment med användning av skopolamin, ett muskarin kolinergisk antagonist. Handlingen visar svaret dämpning under skopolamin injektion kontra ingen injektion när ett mönster som rör sig i cellens önskad riktning presenteras inuti neuron receptiva fält och besöks av djuret. De första två topparna representerar neuronen9; s svar på on- och förskjutningen av den rumsliga kö, som visas i sin receptiva fält. Detta följs av svaret på den rörliga mönster som visas på skärmen 500 ms efter cue debut. Den grå skuggade området visar period analys som används för att beräkna den genomsnittliga eldhastighet för varje prov. Det gröna området belyser den suppressiva inverkan av skopolamin injektion på cellens eldhastigheten. Den mörka gröna området visar undertryckandet inom analysperioden. Figur 4A visar effekten av skopolamin på den genomsnittliga eldhastighet av provet neuron i var och en av de tre uppmärksamhets förhållanden. Neuron s eldhastighet för de två rumsliga uppmärksamhet förhållanden (uppmärksamhet insidan eller utsidan av den receptiva fält av inspelningen neuron) liksom för den sensoriska tillstånd (uppmärksamhet vid fixeringspunkt) sjönk strax efter den första injektionen av injektionskammaren (grå skuggade ära) och under återhämtningsblocket ökade efter en fördröjning på samma nivå som före injektionen. Figur 4B visar en styr inspelning från ett andra prov neuron i vilken saltlösning (0,9% NaCl) injicerades med användning av samma protokoll som för skopolamin injektion. Under injektionen blockera ingen förändring i neuron s eldhastighet observerades jämfört med kontrollblocket. Figur 1. Set-up används för farmakologisk manipulation under inspelning. (A) visar mikroinjektion pumpen och elektrofysiologiska inspelning utrustat med elektroder och mikropipett. Gapet guidetube, i vilken silikonolja införs för att smörja elektroderna och mikropipett, visas förstorad. (B) Visar ett exempel mikropipett (ovan)och inspelning elektrod (nedan). För storlek jämförelse, en eurocent (diameter: 16 mm). Placeras under Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2. Uppgift design för att vägleda rumslig uppmärksamhet. Apor tränades för att detektera en rörelse riktningsändring i cued punktmönstret. Cue var antingen placerad inom neuron receptiva fält (delta-in), såsom visas i figuren, eller utanför den (delta-out). Som en sensorisk kontroll, var apan utbildade för att upptäcka en luminans förändring av fixeringspunkten (delta-fix). Klicka här för att se en större version av denna siffra. < img alt = "Bild 3" src = "/ filer / ftp_upload / 53.724 / 53724fig3.jpg" /> Figur 3. Inverkan av antagonist skopolamin på eldhastighet. Den peri-stimulus tid histogram för ett prov neuron visas för attend-Tillstånds (uppmärksamhet inne i receptiva fält av den inspelade neuron) under insprutningsblocket och under kontrollblocket. X-axeln visar tiden i millisekunder efter cue debut och y-axeln visar avfyrningshastigheten i spikes / sek. Det grå området visar perioden analys (300-800 ms efter stimulans debut) används för att beräkna trial-genomsnitt eldhastighet. Den gröna skuggade området visar undertryckandet i eldhastighet över de två villkor. Den mörkgröna färgen belyser undertryckandet inom skade. Klicka här för att se en större version av denna siffra. iles / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg "/> Figur 4. Effekt av skopolamin och saltlösning på eldhastighet. (A) Antagonist skopolamin injektion. Försöket genomsnittliga eldhastighet av provcellen från figur 3 under loppet av experimentet visas för den föredragna stimulus för alla tre uppmärksamhets förhållanden. X-axeln visar den provstarttiden i minuter och y-axeln visar enhetens avfyrningshastigheten i spikar per sekund. symboler ( delta-in, delta-fix, delta-out) representerar neuron eldhastighet inom den tid som analysen i varje framgångsrikt utfört prov, och horisontella linjer (heldragen linje: delta-in, prickad linje: delta-fix, streckad linje: delta-out) visar genomsnittliga eldhastighet för tre olika experimentella blocks (kontroll, injektion, återvinning). Den grå skuggade området visar injektionsblocket, som börjar med den första injektionen och slutar en minut efter den sista injektionen. Under insprutningsblocket 2 NL 0,1 molar skopolamin injicerades varje minut med en injektionshastighet på 2 NL / s. (B) Saline injektion. Eldhastighet av ett cellprov under loppet av kontrollförsöket visas för den föredragna stimulus för alla tre uppmärksamhets förhållanden. Grå skuggade området visualiserar blocket saltlösning injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här har vi illustrerat i detalj hur man utför tillförlitliga och precisa injektioner och högkvalitativa encelliga inspelningar med en "off-the-shelf" insprutningssystem. Även om denna metod för läkemedelstillförsel har tidigare använts i beter apor (översikt i ^17), systemet som presenteras här har fördelar, granskas nedan.

Såsom visas i fig 4A, kan systemet som beskrivs här åstadkomma stabil mätning av enda neuron-aktivitet med och utan farmakologiska injektioner i direkt närhet av inspelningsplatsen. Såsom visas i figur 4B, insprutning av en kontrollsubstans, saltlösning, inte ledde till en förändring i eldhastighet. Denna kontroll visar att injektionsprocessen i sig har ingen mätbar effekt på tändegenskaperna hos de inspelade nervceller.

Den rumsliga utformningen av neuron, inspelning elektrod, och mikropipett är av avgörande betydelse i dessa experiment. Även om en exakt mätning av deras relativa positioner i vävnaden under inspelning inte är möjlig, kan vi överväga och kontroll för möjliga källor till varians. Först, under volym injektion finns det en risk att neuronen av intresse kan förskjutas bort från den registrerande elektroden, vilket påverkar stabiliteten av inspelade signaler. Av den anledningen är det lämpligt att jämföra eldhastighet före och efter injektionen blocket för att kontrollera signalstabilitet. För det andra definierar konfigurationen styrröret hos registreringssystemet avståndet mellan elektroderna och mikropipett (t ex., 305 | j, m i den koncentriska tre-kanals system som används i detta experiment). Eftersom systemet ger exakt positionsstyrning för djupet av elektroder och mikropipett i vävnaden, kan avståndet mellan dem minimeras genom att noggrant kalibrera relativa djup före inspelning (steg 3,5), och hålla dem på en gemensam djup under inspelningarna.

ent "> Potentiella begränsningar
Förutom in-house kvalitetskontroll av tillverkaren, måste systemet valideras under laboratorieförhållanden, som olika märken av rör, kan sprutor etc. användas och kan leda till skillnader i utkastade volymer. Även om systemet kan användas för att injicera mycket små volymer som i det experiment som visas här, dessa är under minimivolym som kan valideras på grund av praktiska mätgränser i en normal laboratoriemiljö. Emellertid kan större injektionsvolymer att användas för att sluta sig till förhållandet mellan mjukvarudefinierad volymen och volymen matas ut av hårdvaran. Om genomsynliga rör används, är det möjligt en ytterligare visuell kontroll av injektionsprocessen genom att mäta förskjutningen av en visuell markör.

Sätta mikropipett i systemet är mer krävande än elektrod insättning, som diametern på mikropipett är något större och materialet är mer ömtålig. Dessutom,sammanfogning röret till stiftet på mikropipett är utmanande eftersom den medför en hög risk för att bryta den övre delen av mikropipetten. Emellertid är livslängden för en lästs mikropipett flera månader, även med daglig användning.

I praktiken har vi ännu inte stött på en blockering i insprutningssystemet under efter inspelning rengöring av systemet. Icke desto mindre, finns ingen "online" check möjligt, och det finns en risk att en fysisk blockering (såsom vävnaden vid mikropipett spets) fick förhindrar substansen injektion. Det kan därför vara lämpligt att analysera data konservativt, såsom att ta med endast de celler i vidare analys som visar betydande förändringar i bränning hastigheter mellan kontroll och injektions block av experimentet.

Trots sin ringa diameter, kommer mikroelektroder och pipetter förskjuta hjärnvävnad och kan orsaka lokal vävnadsskada. Detta kan minimeras genom att manuellt placera spetsen på the styrrör strax ovanför dura mäter. Elektroderna tränger sedan dura och deras intactness härleds genom att mäta deras impedanser på nätet. Efteråt mikropipett införas. Vid användning av detta tillvägagångssätt, är regelbunden avlägsnande av vävnad ovanför dura rekommenderas för att ytterligare minska risken för elektroden eller pipetten brott.

Jämförelse med alternativa metoder
Systemet som används här visar tydliga fördelar jämfört med andra tryckinsprutningssystem. En stark fördel är diametern på mikropipett (cirka 100 ^ m), som är hälften så stor som andra tillgängliga prober ¹⁷ och minimerar därför neural vävnadsskada. I motsats till tidigare konstruktioner, sysselsätter det nuvarande systemet rumsligt separerade registrerande elektroden och mikropipett. Även om andra system ger ett mindre avstånd mellan elektroden och pipett, det system som beskrivs här möjliggör oberoende djupet ändras av elektroder och pipett, alltså Permitting variabla relativa avstånd i en inspelning. Viktigt är ingen kompromiss om inspelningskvalitet måste göras, eftersom insprutningssystemet är en förlängning av en etablerad färdskrivare. Medan endast en mikropipett och därmed ett ämne används i detta protokoll, är det möjligt att injicera flera ämnen inom en experimentell procedur. För att uppnå detta kan flera mikropipetter vara gängad i separata styrrör och ansluten till sprutor monterade i insprutnings individuella pumpar. Slutligen är lätt styrning av systemet, eftersom det bara behövs ett datorprogram för att avancera elektroderna och mikropipett, och för att utföra tryckinjektion under experimentet.

Jämföra tryck injektion till jontofores, finns det relativa fördelar och nackdelar. Till exempel, kräver tryck injektion större volymer som skall införas in i vävnaden än jontofores, vilket ökar risken för neuronal förskjutning. Den nuvarande protocol används volymer NL intervallet, och vi sällan upplevt märkbara förändringar i en inspelad cellens signalkvaliteten. Systemet tillåter även större volymer som ska injiceras, som är potentiellt användbart för beteende manipulationer men kan påverka stabiliteten i neuronala inspelning. En klar fördel med tryck injektion under jontofores är större utbud av användbara ämnen som det finns inget krav på att använda laddade ämnen. Dock bör pH-värden kontrolleras och jämföras mellan försöks- och kontrollämnen (t ex., Saltlösning).

Frågan kan uppstå varför man ska använda den länge etablerad metod för tryckinjektion i stället för nyare tekniker såsom optogenetik för att manipulera neural aktivitet. Även om väl etablerade i gnagare, optogenetik ännu inte tillförlitligt etablerad i rhesusapor. Framför allt är det inte ändå tillåta den lokala manipulering av celler selektiva för en speciell signalsubstans typ. På längre sikt, ser vistor potential för kombinationen av fördelarna med farmakologiska manipulationer med fördelarna med optogentic manipulationer att belysa den neurala grunden för kognitiva funktioner.

Här har vi visat hur tryck injektion kan användas för att farmakologiskt manipulera ett lokalt begränsat område i hjärnan hos vaken, beter rhesusapor. Vi hoppas att denna metod inspirerar andra forskare att undersöka neuromodulatory bidrag till dynamiken i nervaktivitet.

Materials

(-)-Scopolamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339.81 g/mol
NaCl 0.9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	enzyme detergen
Hydrogen peroxide	Roth		Used in 3% solution with deionized water
Ethanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Deionized water
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Syringe and needle
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Quarzglass micropipette	Thomas Recording
Recording electrode	Thomas Recording		quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ  and 0.3-0.5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Superglue
Silicon oil	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761———-R	Syringe filter
Multichannel Micro Injection System	Thomas Recording		multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump
McLab	custom		internal lab software to control stimulus presentation