En Pressure Injection System til Undersøgelse af Neuropharmacology of Information Processing i Awake Behaving makak Monkey Cortex

Summary

Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.

Abstract

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.

Introduction

In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine¹. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies², as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals³ and systemic pharmacological manipulations in humans⁴. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems^5,6 and can lead to changes in neural activity³.

Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug⁷. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules⁸, correlating with the tip diameter⁹ of the micropipette as well as with the concentration⁸ of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used¹⁰, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.

Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley¹¹ for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain¹²) to a defined brain area¹³ while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette¹³. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly¹⁴ and intracellularly^15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see¹⁷ for a comparison of recent pressure injection systems).

An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.

The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.

Protocol

Animal pleje og alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med tyske love om dyrs pleje og godkendt af distriktet regering Braunschweig, Niedersachsen, Tyskland. Bemærk: Da eksperimentet udføres in vivo, er det afgørende at fastholde de højest mulige hygiejnestandarder. Når det er muligt, arbejde under sterile forhold. 1. Forberedelse af Injection / Recording System Steriliser røret, der forbinder mikropipette med sprøjten. Brug den korteste rørlængde mulig i den eksperimentelle opstilling mellem indsprøjtningspumpen og elektrofysiologiske registreringssystem. Rengør guide rør af optagelsen system ved hjælp af rengøring ledninger. Dyp dem i sterilt silikoneolie og fodre dem gennem de individuelle vejledning rør flere gange. Sæt kvartsglas mikropipetten til et føringsrør af registreringssystemet. Se figur 1A. Efter fastsættelse mikropipetten iregistreringssystemet, vedhæfte den sterile rør til metallet pin af mikropipetten. Pas på; selvom mikropipetten er fikseret i systemet, kan let knække, når fastgørelse af røret. Brug to sterile pincet til at anvende samme tryk på pin og rør. Brug flydende superlim til at forsegle krydset mellem røret og mikropipette. Vent mindst 3 timer for limen at hærde før fyldning mikropipetten med væske. Indsæt mikroelektroder (fx kvarts glas isoleret platin wolfram) ind i de øvrige positioner af registreringssystem før eller efter mikropipette indsættelse. 2. Forberedelse af stoffet Sterilisere 1,5 ml mikrocentrifugerør til senere opbevaring af injektionsopløsninger bruger en autoklave eller andre pålidelige procedure. Vej den tilsvarende stof scopolamin-hydrochlorid til fremstilling af 5 ml af en 0,1 molær opløsning. Opløses i sterilt saltvand (0,9% NaCl). Under sterile forhold ina fume hood, filtreres opløsningen under anvendelse af en sprøjte filter med tilstrækkelig stor porediameter, f.eks 0,2 um. Under stinkskab alikvoter opløsningen i mængder der er tilstrækkelige til et enkelt eksperiment, fx, for scopolamin, 500 pi i steril 1,5 ml mikrocentrifugerør. Brug mørke rør til at beskytte stoffet mod lys; alternativt, wrap rør i alufolie. For scopolamin, opbevare opløsningen i op til 14 dage ved 4 ° C. 3. Daglig Forberedelse af Injection / Recording System Bemærk: Ved montering i registreringssystemet er elektroderne og mikropipette lagret i en enzymopløsning (Tergazyme, 1% opløsning med demineraliseret vand) mellem optagelser. skal udføres følgende trin, før hver optagelse. Saml et rør af det stof, der skal injiceres. Lad det nå RT hvis nedkølet. Fjern injektionen / registreringssystem fra enzymopløsningen og skyl elektroderog mikropipette med deioniseret vand til at rengøre fuldstændigt enzymopløsning. Fjern frontdækslet af optagelsen system for at visuelt kontrollere forseglingen mellem mikropipette og rør. Påfør steril silikoneolie til føringsrør hul (se figur 1A) og tips af elektroder og mikropipette for at smøre systemet til jævn bevægelse. Check tips af elektroder og mikropipette bruger et mikroskop for at sikre, at de er intakte. Juster elektroderne og mikropipette under mikroskop, så at de strækker sig ud af lederør med samme længde. Kør dem i føringsrør, stopper så snart de ikke længere er synlige. Dette defineres som elektrode nulposition. Indstil dybden af ​​elektroderne og mikropipette til 0 i softwaren. Fyld en steril sprøjte med sterilt saltvand og stik nålen ind i røret, pas på ikke at gennembore væggen af ​​røret. Kør mikropipetten ud af vejledningen rør til visual styring af stof flow. Flush mindst 2 ml sterilt saltvand gennem røret og mikropipette for at sikre ingen luft tilbage i sprøjten eller i røret. Brug ikke for meget pres på sprøjtens stempel. Sørg krydset mellem røret og mikropipette er forseglet. Hvis lækagen er synlig, re-lim krydset (se trin 1.5) og udskyde optagelsen. Fyld en ny steril sprøjte med opløsningen, der skal injiceres og bytte den med cylinder saltvand sprøjten, dvs. holde nålen i den saltvand fyldt injektionssprøjte i røret. Sørg for, at ingen luft overføres ind i systemet. Det opnås bedst ved at fylde nålen hub med saltvand efter fjernelse af saltvand fyldt tønde. Skylle systemet med 250 pi af opløsningen, der skal injiceres, for helt at fjerne saltvand fra røret. Brug af motorstyring software, trække elektroder og mikropipette i guidetubesto en dybde på mindst -500 um. <li> Sænk styrerøret ring (figur 1A) til bunden af styrerørene at opretholde deres fast relativ position. Rens bunden af ​​systemet med ethanol, især hvor det vil røre abens optagelse kammer. Luk registreringssystem ved at udskifte frontdækslet og stramme skruerne. 4. Validering af indsprøjtningssystemet Bemærk: Selv om virksomheden kalibrerer systemet, anbefales det at validere de bortvist mængder med de anvendte i den eksperimentelle opstilling (rør, sprøjter etc.) materialer. Forberede systemet som beskrevet i trin 3, at holde elektroder og mikropipette forlænget ud af styrerørene. Der anbefales en dybde på mindst 7.000 um at undgå tab af målevolumen grund adhæsion langs den ydre overflade af mikropipetten og elektroder. Placer registreringssystem i den stilling, den vil blive anvendt i løbet af eksperimentet og sætte Syringe ind i mikroinjektion pumpe. Fastgør sprøjten på plads ved hjælp af elastik og justerbar greb (se figur 1A). Skub den bevægelige del af pumpen, indtil det er på plads bag stemplet af sprøjten. Brug af softwaren kontrollerede motorenhed, skubbe en volumen stor nok til at blive målt præcist, f.eks., 1000 nl. Det foretrækkes at anvende et enkelt trin for at udstøde det totale volumen for at undgå virkningerne af kapillarvirkning langs mikropipette overflade. Meget lave hastigheder (1 nl / s) kan også føre til denne effekt under valideringsproceduren. Indsamle det samlede volumen i en beholder placeret under mikropipette eller omhyggeligt indsamle den udstødte drop direkte fra spidsen af ​​mikropipetten. Vurdere skubbet volumen ved hjælp af en pipette eller ved vejning med en præcision skala. Gentag proceduren flere gange for at bekræfte målinger. 5. Akutte Optagelser Indstil xy positionaf registreringssystemet. Dette definerer det punkt, hvor styrerørene nå dura mater i kronisk implanterede optagelse kammer. Sørg de vejledende rør er trukket helt (føringsrør z position 0). Bring registreringssystemet i position og placere sprøjten i mikroinjektion pumpe. Fastgør sprøjten på plads ved hjælp af elastik og justerbar greb (se figur 1A). Skub den bevægelige del af pumpen, indtil det er på plads bag stemplet af sprøjten. Hvis en dråbe stof er synlig på spidsen af ​​de vejledende rør, forsigtigt fjerne det ved hjælp af en steril vatpind. Forbered dyret til optagelse i overensstemmelse med laboratoriets procedure (se 18 f.eks retningslinjer). Sikker montere registreringssystem på optagelsen kammer aben. Langsomt manuelt sænke lederør ind i optagelsen kammeret, indtil dura er nået, derefter køre elektroderne ved hjælp af motor control software. Da det ikke er muligt at måle impedans på mikropipetten, første drev med elektroder og kontrollere deres impedanser regelmæssigt i forskellige dybder. Efter en gennemtrængning af dura er positivt resultat uden at beskadige elektroderne, forhånd mikropipetten. Drive elektroderne og mikropipetten til målet elektrode dybde, i hvilken forventes hjernen område af interesse, der skal findes. avancere langsomt elektroden indtil det er tæt nok til at registrere aktiviteten af ​​en enkelt enhed, som det fremgår af et godt signal-til-støj-forhold i det optagede signal. Vigtigere, placere registreringselektroden og mikropipetten i samme dybde for at sikre den mindste afstand mellem elektrode og mikropipette. Hvis det er muligt, holde elektroderne og mikropipette i denne dybde for hele optagelsen. Men hvis den eneste måde at opretholde signalkvaliteten af ​​det optagne celle er at flytte elektroderne, derefter køre elektroderne og mikropipettensamtidigt at opretholde afstanden mellem dem. 6. Rumlig Opmærksomhed Opgave I en række forsøg, der er til stede to bevægelige prikmønstre på skærmen, en placeret inden for det receptive felt af den optagede neuron og den anden uden for det, sammen med en centralt præsenteret fiksering punkt, at dyret skal foveate hele hvert forsøg 19, 20. Bemærk: Aben er uddannet til at reagere på en retningsændring i cued prikmønster (målet begivenhed) samtidig ignorerer enhver retning ændring i den anden prik mønster, og bliver belønnet med en dråbe væske for hver vellykket gennemførelse af en retssag 19, 20. Som en sensorisk kontrol tilstand, aben har at rapportere en luminans ændring af fiksering punkt, mens ignorerer både bevægelige dot mønstre (se figur 2 for en nærmere beskrivelse af opgaven). 7. Farmakologisk manipulation Mens optagelse <p> Bemærk: Mens aben udfører opgaven, injicere stoffet i en blok-wise måde. Tre på hinanden følgende blokke er defineret: kontrol, der fungerer som en baseline; injektion, hvorunder et stof udstødes; og nyttiggørelse, hvor cellerne rettet ved injektion tilbagevenden til baseline. Under en injektion blok, indsprøjte en foruddefineret mængde af stoffet med regelmæssige mellemrum, f.eks., 2 nl hvert minut ved en hastighed på 2 nl / s. I dette eksempel bruger scopolamin hydrochlorid. Injektionen processen styres ved hjælp af software, som giver forskellige muligheder. Brug f.eks trin funktion til at definere injektion volumen, og tryk på dosisknappen hvert minut i henhold til uret af optagelsen software. Bemærk: Den nøjagtige varighed af injektionen blokken er substans og eksperimentere afhængig, fx til scopolamin brug 2 nl injektioner hvert minut i 10 min (20 nl i alt).. Det er bedst ikke at fremme elektroderne og mikropipette During injektionen blok. Bemærk tiden og forsøget i hvilken stoffet injiceres, dybden af ​​elektroderne og mikropipette, samt mængden af ​​udstødes stof. Følg injektion blok med et opsving blok, i hvilken ingen substans injiceres. Varigheden af ​​inddrivelsen blokken er stofspecifikke og skal defineres i pre-tests. Overvåg og vedligeholde registrering kvaliteten af ​​de udvalgte enkelte enheder indtil udgangen af ​​opsvinget blokken. Gentag de tre blokke, så længe optagelsen kvalitet og motivation af aben tillade. 8. Indlæg registreringsprocedurer Efter registrering af data, trække elektroder og mikropipette i de vejledende rør og derefter manuelt trække de vejledende rør. Fjern registreringssystem fra optagelsen kammer aben. Slip sprøjten fra indsprøjtningspumpen og overføre systemet til forberedelse område for rengøring. Håndter dyret(herunder rensning af optagelsen kammeret 18) i overensstemmelse med standardprocedurer i laboratoriet og returnere det til huset facilitet. Skyl ydersiden af ​​styrerørene med hydrogenperoxid (3%) og derefter med deioniseret vand. Drev elektroder og mikropipette ud af de vejledende rør, skyl med hydrogenperoxid og derefter deioniseret vand. Udveksle sprøjtens cylinder med en tønde en sprøjte fyldt med sterilt saltvand holde nålen i røret. Skyl røret og mikropipette med 1-2 ml saltvand. Efter skylning, fjerne tønden og fyld den med luft. Genindsætte cylinderen ind i nålen og tør røret og mikropipetten indefra ved forsigtigt at skubbe luft gennem. Opbevar føringsrør, udvidede elektroder og mikropipette nedsænket i enzymet løsning til at undgå udtørring og for at sikre fordelingen af ​​organisk materiale.

Representative Results

Figur 2 viser den rumlige opmærksomhed opgave aben udføres, mens injektionsprocessen blev udført. Aben blev trænet til at deltage til enten stimulus placeret inden det receptive felt af det optagede neuron (deltage-i), stimulus placeret uden for det receptive felt (deltage-out) eller fiksering point (deltage-fix). Disse betingelser tillader en sammenligning af neuronal aktivitet i forskellige opmærksomhedsgraden stater. Figur 3 viser et peri-stimulus tid histogram for en prøve neuron i et eksperiment under anvendelse af scopolamin, en muscarincholinerg antagonist. Plottet viser respons undertrykkelse under skopolamin injektion versus ingen indsprøjtning, når et mønster bevæger sig i cellens foretrukne retning præsenteres inde i neuron er modtagelig felt og med deltagelse af dyret. De to første toppe repræsenterer neuron9; s svar på on- og offset af den rumlige cue, som vises inde i sin modtagelige felt. Dette er efterfulgt af reaktion på den bevægende mønster, som vises på skærmen 500 ms efter cue indtræden. Det grå skraverede område viser den betragtede periode bruges til at beregne den gennemsnitlige fyring sats for hver retssag. Det grønne område fremhæver undertrykkende indflydelse af skopolamin indsprøjtning på cellens skudhastighed. Den mørkegrønne område viser undertrykkelsen inden den betragtede periode. Figur 4A viser virkningen af scopolamin på den gennemsnitlige fyringshastighed af prøven neuron i hver af de tre koncentrationsproblemer betingelser. Neuron fyring sats for de to rumlige opmærksomhed betingelser (opmærksomhed inden for eller uden for det receptive felt af optagelsen neuron) såvel som for den sensoriske tilstand (opmærksomhed på fiksering point) faldt kort efter den første injektion af injektionen blok (grå skygge era), og under opsvinget blok steg efter en forsinkelse på samme niveau som før injektionen. Figur 4B viser en kontrol optagelse fra en anden prøve neuron, hvor saltvand (0,9% NaCl) blev injiceret under anvendelse af den samme protokol som for scopolamin injektion. Under injektionen blokere blev ikke observeret nogen ændring i neuron fyring sats sammenlignet med styreblokken. Figur 1. Set-up anvendt til farmakologisk manipulation under optagelse. (A) viser de mikroinjektion pumpen og elektrofysiologiske registreringssystem udstyret med elektroder og mikropipette. Den guidetube hul, ind i hvilket siliconeolie er indsat til at smøre elektroderne og mikropipette, er vist forstørret. (B) Viser et eksempel mikropipette (ovenfor)og optagelse elektrode (nedenfor). For størrelse sammenligning, en eurocent (diameter: 16 mm). Er placeret under Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. Opgave design til at guide rumlig opmærksomhed. Monkeys blev trænet til at opdage en bevægelse retning ændring i det cued dot mønster. Køen blev enten placeret inden i neuron s receptive felt (deltage-i), som vist i figuren, eller uden for det (deltage-out). Som en sensorisk kontrol, blev aben uddannet til at opdage en luminans ændring af fiksering point (deltage-fix). Klik her for at se en større version af dette tal. < img alt = "Figur 3" src = "/ files / ftp_upload / 53.724 / 53724fig3.jpg" /> Figur 3. Indflydelse af antagonist scopolamin på skudhastighed. Den peri-stimulus tid histogram for en prøve neuron er vist for attend-i betingelse (opmærksomhed inde det receptive felt af det optagede neuron) under injektionen blok og under styreblokken. X-aksen viser tiden i millisekunder efter cue indtræden og y-aksen viser afbrændingstakten i spikes / sek. Det grå område viser den betragtede periode (300-800 ms efter stimulus debut), der anvendes til at beregne trial-gennemsnit fyring sats. Det grønne skraverede område viser undertrykkelsen i fyring sats på tværs af de to betingelser. Den mørkegrønne farve fremhæver undertrykkelse inden for den betragtede periode. Klik her for at se en større version af dette tal. Iles / ftp_upload / 53.724 / 53724fig4.jpg "/> Figur 4. Virkning af scopolamin og saltvand på skudhastighed. (A) Antagonist scopolamin injektion. Forsøget-gennemsnit afbrændingstakt af prøvecellen fra figur 3 i løbet af forsøget er vist for den foretrukne stimulus for alle tre koncentrationsproblemer betingelser. X-aksen viser forsøget starttidspunktet i minutter og y-aksen viser enhedens fyring sats i pigge pr sekund. Symboler ( deltage-i, deltage-fix, deltage-out) repræsenterer neuron er fyring sats inden for den betragtede periode i hver positivt resultat retssag, og vandrette linjer (fuldt optrukket linie: deltage-i, stiplet linie: deltage-fix, stiplet linje: deltage-out) viser gennemsnitlig fyring sats for tre forskellige eksperimentelle blocks (kontrol, injektion, nyttiggørelse). Det grå skraverede område viser injektionen blokken, begyndende med den første injektion og slutter 1 min efter den sidste injektion. Under injektionen blok 2 nL af 0,1 molær scopolamin blev injiceret hvert minut med en injektion hastighed på 2 nl / s. (B) Saline injektion. Afbrændingstakten af ​​en prøvecelle løbet af kontrolforsøg er vist for den foretrukne stimulus for alle tre koncentrationsproblemer betingelser. Grå skraverede område visualiserer blokken af saltvand injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her har vi illustreret i detaljer, hvordan du udfører pålidelige og præcise injektioner og høj kvalitet encellede optagelser med en "off-the-shelf" pres indsprøjtningssystem. Mens der tidligere har været anvendt denne metode til levering lægemiddel i opfører aber (anmeldt i ^17), systemet præsenteres her har fordele, anmeldt nedenfor.

Som illustreret i figur 4A, kan den her beskrevne system, tilvejebringe stabil måling af enkelt neuron aktivitet med og uden farmakologiske injektioner i umiddelbar nærhed af optagelsen site. Som vist i figur 4B, indsprøjtning af et kontrolstof, saltvand, ikke førte til en Ændring af ydelsen. Denne kontrol viser, at injektionsprocessen i sig selv har nogen målbar indflydelse på standpladsen egenskaber af de optagede neuroner.

Den rumlige konfiguration af neuron, optagelse elektrode, og mikropipette er af afgørende betydning i disse eksperimenter. Selv om en præcis måling af deres indbyrdes placering i vævet under optagelse ikke er mulig, kan vi overveje og kontrol for mulige kilder til varians. Først under volumen injektion er der en risiko for, at neuron af interesse kan forskydes bort fra kontrolapparatet elektrode, påvirker stabiliteten i registrerede signaler. Af denne grund er det klogt at sammenligne afbrændingstakt før og efter injektionen blok at verificere signal stabilitet. For det andet, lederøret konfiguration af registreringssystemet definerer afstanden mellem elektroderne og mikropipette (fx., 305 um i den koncentriske 3-kanalsystemet anvendt i dette eksperiment). Da systemet giver præcis position kontrol for dybden af ​​elektroder og mikropipette i vævet, kan afstanden mellem dem minimeres ved omhyggelig kalibrering relative dybde inden optagelse (trin 3.5), og holde dem på en fælles dybde under optagelser.

ent "> Potentielle begrænsninger
Udover intern kvalitetskontrol af fabrikanten, skal valideres under laboratoriebetingelser, som forskellige mærker af rør i systemet, kan sprøjter etc. anvendes og kunne føre til forskelle i udslyngede mængder. Selv om systemet kan bruges til at injicere meget små volumener som i det viste forsøg her, disse er under minimum volumen, der kan valideres på grund af praktiske måling grænser i en normal laboratoriemiljø. Imidlertid kan større injektionsvolumener bruges til at udlede forholdet mellem softwaren definerede volumen og volumenet udstødes af hardwaren. Hvis der anvendes transparente rør, er det muligt yderligere visuel kontrol af injektionsprocessen ved at måle forskydningen af ​​en visuel markering.

Indsættelse mikropipetten i systemet er mere krævende end elektrode insertion, som diameteren af ​​mikropipetten er lidt større og materialet er mere skrøbelig. Desuden,er udfordrende sammenføjning slangen til pin af mikropipetten eftersom det medfører en høj risiko for at bryde den øverste del af mikropipetten. Men levetiden for en indlæst mikropipette er flere måneder, selv med daglig brug.

I praksis har vi endnu ikke stødt på en blokering i indsprøjtningssystemet under post-optagelse rensning af systemet. Alligevel ingen "online" kontrol er mulig, og der er en risiko for, at en fysisk blokering (såsom væv på mikropipettespidsen) kan forhindre stoffet injektion. Det kan derfor være tilrådeligt at analysere data konservativt, såsom herunder kun de celler i yderligere analyse, der viser betydelige ændringer i fyring satserne mellem kontrol- og injektion blokke af eksperimentet.

På trods af deres lille diameter, vil mikroelektroder og pipetter fortrænge hjernevæv og kan forårsage nogle lokale vævsskader. Dette kan minimeres ved manuelt at placere spidsen af ​​the lederør lige over dura mater. Elektroderne derefter trænge ind i dura og deres intakt udledes ved at måle deres impedanser online. Bagefter indsættes mikropipette. Når denne fremgangsmåde benyttes, anbefales regelmæssig fjernelse af væv over dura for yderligere at reducere risikoen for elektroden eller pipette brud.

Sammenligning med alternative metoder
Den her anvendte systemet viser klare fordele i forhold til andre tryk injektionssystemer. En stor fordel er diameteren af mikropipetten (ca. 100 um), som er halvt så stor som andre tilgængelige prober ¹⁷ og minimerer derfor neuralt væv skader. I modsætning til tidligere designs, beskæftiger det nuværende system rumligt adskilt optagelse elektrode og mikropipette. Selv om andre systemer giver en mindre afstand mellem elektrode og pipette, den her beskrevne system tillader uafhængige dybde ændringer af elektroder og pipette, således Permirg ø ring variable relative afstande inden en optagelse. Vigtigt er det, behøver ingen kompromis med hensyn optagekvalitet skal foretages, som indsprøjtningssystemet er en udvidelse af en etableret optageenhed. Mens kun én mikropipette og dermed et stof anvendes i denne protokol, er det muligt at injicere flere stoffer i en eksperimentel procedure. For at opnå dette, kan flere mikropipetter skrues i separate styrerør og forbundet til sprøjter monteret i individuelle injektionspumper. Endelig kontrollerer systemet er let, da kun én computer program er nødvendigt at fremme elektroderne og mikropipette, og til at udføre trykket injektion under eksperimentet.

Sammenligning tryk injektion til iontoforese, der er relative fordele og ulemper. F.eks indsprøjtningstryk kræver større mængder, der skal føres ind i vævet end iontoforese, hvilket øger risikoen for neuronal forskydning. Den nuværende protocol brugte bind i nL sortiment, og vi sjældent oplevet mærkbare ændringer i en optaget celle signal kvalitet. Systemet giver også større mængder skal injiceres, som er potentielt anvendelige til adfærdsmæssige manipulationer men kan påvirke stabiliteten af ​​neuronal optagelse. En klar fordel ved pres injektion over iontophorese er større vifte af brugbare stoffer, da der ikke er krav til at bruge ladede stoffer. Dog bør pH-værdier kontrolleres og sammenlignes mellem eksperimentelle og kontrol stoffer (f.eks., Saltvand).

Spørgsmålet kunne opstå, hvorfor at bruge veletablerede metode pres indsprøjtning i stedet for nyere teknikker som optogenetics for at manipulere neurale aktivitet. Selvom veletableret i gnavere, optogenetics endnu ikke pålideligt etableret i rhesusaber. Især er det endnu ikke muligt for lokale manipulation af celler selektive for en bestemt neurotransmitter type. På længere sigt ser vistort potentiale for kombinationen af ​​fordelene ved farmakologiske manipulationer med fordelene ved optogentic manipulationer til at belyse det neurale grundlag af kognitive funktioner.

Her har vi vist, hvordan indsprøjtningstryk kan anvendes til farmakologisk manipulere et lokalt begrænset område i hjernen af ​​vågen, opfører rhesusaber. Vi håber, at denne metode inspirerer andre forskere til at undersøge neuromodulatory bidrag til dynamikken i neuronal aktivitet.

Materials

(-)-Scopolamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339.81 g/mol
NaCl 0.9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	enzyme detergen
Hydrogen peroxide	Roth		Used in 3% solution with deionized water
Ethanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Deionized water
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Syringe and needle
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Quarzglass micropipette	Thomas Recording
Recording electrode	Thomas Recording		quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ  and 0.3-0.5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Superglue
Silicon oil	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761———-R	Syringe filter
Multichannel Micro Injection System	Thomas Recording		multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump
McLab	custom		internal lab software to control stimulus presentation