Här presenterar vi ett protokoll för att inducera okulär hypertension i det murina ögat som resulterar i förlust av retinala ganglionceller såsom observerats i glaukom. Magnetiska mikropärlor injiceras i den främre kammaren och attraheras av iridokorneal vinkel med en magnet för att blockera utflödet av kammarvatten.
Användningen av gnagarmodeller av glaukom har varit viktigt att förstå de molekylära mekanismer som ligger bakom patofysiologin av denna multifaktoriell neurodegenerativ sjukdom. Med tillkomsten av ett stort antal transgena mus linjer, det finns ett ökande intresse för inducerbara musmodeller av okulär hypertension. Här presenterar vi en ocklusion modell glaukom bygger på injektion av magnetiska mikrokulor i den främre ögonkammaren med hjälp av en modifierad mikronål med en facetterad avfasning. De magnetiska mikropärlor lockas till iridokorneal vinkel med en handhållen magnet för att blockera dräneringen av kammarvatten från den främre kammaren. Denna störning i vattenhaltiga dynamikresulterar i en stadig höjning av intraokulärt tryck, som därefter leder till förlust av retinala ganglionceller, såsom observerats i glaukompatienter humana. Modellen mikrokorn ocklusion som presenteras i detta manuskript är enkel jämfört med andra inducerbara modeller av glaukom och också mycketeffektiv och reproducerbar. Viktigt är de ändringar som presenteras här minimera vanliga problem som ofta uppstår i ocklusion modeller. För det första, användningen av en avfasad glas mikronål förhindrar återflöde av mikropärlor och säkerställer att minimal skada uppstår på hornhinnan under insprutningen, vilket minskar skaderelaterade effekter. För det andra, användningen av magnetiska mikropärlor säkerställer förmågan att attrahera de flesta pärlor till iridokorneal vinkel, vilket effektivt minskar antalet kulor flyter i den främre kammaren att undvika kontakt med andra strukturer (t ex., Iris, lins). Slutligen har användningen av en handhållen magnet medger flexibilitet vid hantering av den lilla musen ögat för att effektivt rikta de magnetiska mikropärlor och se till att det finns lite återflöde av mikropärlorna från ögat när mikronålen dras tillbaka. Sammanfattningsvis mikrokornet ocklusion musmodell som presenteras här är ett kraftfullt undersökande verktyg för att studera neurodegenerativa förändringar som sker under uppkomsten och utvecklingen av Glaukoma.
Glaukom är en progressiv och irreversibel blindhet tillstånd som påverkar uppskattningsvis 80 miljoner människor över hela världen av 2020 en. I glaukompatienter är synbortfall orsakas av selektiv död av retinala ganglieceller (RGC), utgångs nervceller som sänder visuell information från näthinnan till hjärnan. Glaukom är en åldersrelaterad neurodegenerativa sjukdomar med många riskfaktorer som den vanligaste är förhöjt intraokulärt tryck (IOP). I själva verket är IOP den enda modifierbara riskfaktorn vid glaukom och nuvarande behandlingar fokuserar enbart på att hantera ögontryck. Men flera genetiska, cellulära, och miljömässiga faktorer påverkar uppkomsten och utvecklingen av denna sjukdom. Därför att förstå de olika mekanismer som i slutändan bidrar till neuronal död är viktigt att utveckla effektiva behandlingar för glaukom.
Djurmodeller av glaukom är viktigt att studera sjukdoms patofysiologi samt att identifiera och testalovande läkemedel. Den ökande tillgången av transgena mus linjer inklusive villkorad knockout stammar och möss som bär genetiskt kodade fluorescerande spårämnen har drivit på behovet av inducerbara murina glaukom modeller. Flera gnagarmodeller av glaukom har utvecklats under årens lopp (översikt i 2,3). I många av dessa modeller är glaukom induceras genom att bryta vatten humor dynamik, vilket resulterar i förhöjning av IOP. Ocklusion modeller, där mikrokulor eller andra ämnen injiceras i den främre ögonkammaren för att blockera vatten dränering, har vunnit popularitet under de senaste åren delvis på grund av deras relativa lätthet att öka IOP 4-14.
Mikrokornet ocklusion modell av glaukom, först genomförs i primater 12, kaniner 8, och råttor 4,9,11, har nyligen anpassats för användning i möss 5,6,10. I dessa studier var den intrakameral injektion av polystyren mikrokulor, ensam eller ikombination med ett viskoelastiskt material, resulterade i IOP höjd leder till efterföljande RGC död 6,10. Men återflöde när nålen dras tillbaka från ögat och lossnar av mikrokulor från iridokorneal vinkel är vanliga problem som uppstår under förfarandet. För att minimera dessa nackdelar, har magneter använts för att locka de magnetiska mikrokulor till iridokorneal vinkel i ögat 4,9.
Protokollet som beskrivs här är ett modifierat förfarande baserat på tidigare studier 9,10 som använder magnetiska mikropärlor och en handhållen magnet anpassad till musen ögat (Figur 1). Flera viktiga ändringar har införts i våra protokoll för att säkerställa en effektiv och reproducerbar IOP ökning av möss. Först injektion av mikropärlor görs med hjälp av en genomtänkt glas mikronål med en facetterad avfasning. De resulterande släta ytorna av mikronålen samt dess vassa spetsen säkerställer att minimal skada ärtillfogat som punkterar hornhinnan. Användningen av detta glas mikronål resulterar också i ökad kontroll när microneedle spetsen kommer in i främre kammaren, vilket minskar risken för skador på närliggande strukturer såsom iris och linsen. Dessutom underlättar den lilla injektions skada hornhinnan självläkande och minskar oönskade skaderelaterade effekter.
För det andra, insprutningen av magnetiska mikropärlor och användningen av en handhållen magnet ger exakt kontroll för att attrahera kulorna till iridokorneal vinkel i den lilla musen ögat. Magnetiska mikrokulor som är 4,5 mikrometer i diameter användes eftersom denna mikrokorn storlek inte täppa till beredd mikronål öppning och viktigare, en gång injiceras dessa mikrokulor effektivt blockerade dränering av kammarvatten. Detta tillvägagångssätt minskar inte bara återflöde av de injicerade mikropärlor, men också ser till att ett maximalt antal mikropärlor ackumuleras i målområdet för att effektivt blockera kammarvatten dränering. furthermore, denna strategi minskar också antalet kulor flyter i den främre kammaren att undvika kontakt med andra strukturer, såsom iris och linsen, och förhindrar passage till den bakre kammaren. Sammantaget visar dessa modifieringar säkerställa att mikrokornet injektion kirurgi utförs med relativ lätthet och på ett lämpligt sätt som resulterar i ett mycket reproducerbart, effektivt, och ihållande induktion av okulär hypertension i möss.
Tekniken video presenteras här ger detaljerade steg-för-steg-instruktioner om hur du utför intrakameral injektion av magnetiska mikropärlor för att effektivt och reproducerbart framkalla IOP höjd i möss. Denna procedur resulterar i ihållande IOP ökning som inte kräver ytterligare injektioner och främjar detekterbar RGC soma och axon förlust under de första 3 veckorna av okulär hypertension induction.Elevated IOP är en stor riskfaktor för att utveckla glaukom hos människa. Därför är detta en värdefull mus okulär hypertension beroende glaukom modell som har potential för ett brett spektrum av applikationer.
En gemensam nackdel förknippad med injektion av mikrokulor i den främre kammaren hänför till vulst återflöde genom injektionsstället när nålen dras tillbaka, vilket ofta resulterar i endast partiell obstruktion av vattenhaltig utflöde och ökad variabilitet. För att lösa detta problem, har flera viktiga ändringar genomförs. granar t, det noggranna förberedelser av en ren, skarp glas mikronål med en facetterad avfasning är avgörande för en framgångsrik injektion av mikropärlor. En väl förberedd mikronål möjliggör kontrollerad och jämn penetrering av hornhinnan med minimal påläggning av tryck till den känsliga ögonytan. Den lilla hornhinnan punktering förhindrar återflöde av mikropärlor. Dessutom minskar den fina mikronål risken för skada närliggande strukturer såsom iris och linsen, vilket kan leda till icke-sjukdomsrelaterade inflammation. För det andra är tillämpningen av en handhållen magnet för strategiska okulära områden under och efter injektionen en annan viktig aspekt av denna teknik. Under insprutningen är magneten används för att dra de magnetiska mikropärlor till den främre kammaren förhindrar återflöde av de mikropärlor när mikronålen dras tillbaka. Efter injektionen är magneten sedan för att styra mikropärlorna till iridokorneal vinkel för att blockera kammarvattenutflöde.
tält "> Ett annat problem som ofta uppstår i mikrokorn ocklusion modeller är att upprepade pärla injektioner är ofta nödvändigt att uppnå en varaktig IOP höjd 10,11. Detta kan vara ett resultat av mikropärlor lossnar från iridokorneal vinkel med tiden. Kombinationen av en handhållen magnet, såsom beskrivits ovan, och positioneringen av mus-postoperativt kraftigt förbättrar resultatet. användningen av injicerbara narkosmedel, som tillåter flexibilitet för att förflytta huvudet under förfarandet och kräver en längre postoperativ återhämtningsperiod, gynnas. Placering av mus med det opererade ögat uppåt i ett par timmar efter operationen bidrar till reglering av mikrokulor på iridokorneal vinkel och minskar risken för lossnar tillbaka in i den främre kammaren.Att se till att antalet injicerade pärlor är relativt konsekvent är en annan viktig steg för att minimera inter-djurvariationer. Eftersom mikropärlorna lösa på bottom av röret, är det nödvändigt att fullständigt homogenisera mikrokornet lösningen och dra den lämpliga volymen i mikronålen i tid. Injektion av färre pärlor i den främre kammaren kan resultera i ofullständig blockering av vattenstrukturer humor dränering, vilket sannolikt kommer att leda till dålig eller variabel IOP höjd. Notera även det yttersta syftet med mikrokornet injektion är att lyfta IOP, försiktighet bör iakttas vid IOP mätningar från vaken möss är högre än de toppvärden som rapporteras i denna studie (~ 25 mmHg). Extremt höga lOP ökar risken för ischemisk skada och kan även orsaka smärta för djuret. Höjden av IOP bör betraktas som en av många faktorer att bedöma framgången av operationen. Som sådan bör resultatet av förfarandet mätas baseras på flera parametrar inklusive IOP höjd, RGC soma död, och Axon förlust.
Även det protokoll som beskrivs här resulterar i de flesta mikropärlor framgångsrikaly lösa på vinkeln, är en potentiell begränsning av denna modell att dessa pärlor som förblir flytande i den främre kammaren kan störa levande retinal imaging genom hornhinnan, liksom elektro eller beteendemässiga analyser som kräver en effektiv passage av ljus. En annan viktig aspekt att beakta när man använder denna mikrokornet ocklusion modell är att omfattningen av IOP höjd och efterföljande RGC degeneration varierar med ålder och genetisk bakgrund av den opererade mus [4]. Därför kommer omfattningen av IOP höjd och tidslinje RGC degeneration måste fastställas för varje specifik transgen mus linje och / eller åldersgrupp.
Ett inslag i denna modell är att förhöjda lOP resulterar i den gradvisa förlusten av RGC död under de första tre veckorna efter mikrokorn injektion och betydande RGC död detekteras vid 3 veckor efter ingreppet. Hence, möjliggör en undersökning av tidiga och / eller subtila förändringar som sker i detta d denna modellisease före öppen RGC soma och axon förlust. En betydande ökning av RGC död observerades inte mellan 3 och 6 veckor efter induktion av okulär hypertension. I själva verket förblev RGC soma och axon förlust stabil vid ~ 22-25% mellan 3 och 6 veckor trots framgångsrik och ihållande IOP höjd vid dessa tidpunkter. En längre duration av ihållande IOP kan behövas för ytterligare RGC förlust inträffa i C57BL / 6 möss, som verkar vara mer motståndskraftiga mot RGC skada jämfört med andra musstammar. 5 Ytterligare modifieringar till protokollet presenteras här, inklusive justering av pärla storlek och ytterligare injektioner, kan krävas för att studera RGC förlust vid senare tidpunkter. Därför är våra protokoll idealisk för studier fokuserade på tidiga patofysiologiska förändringar som korrelerar med blygsamma RGC neurodegeneration som är relevanta för insättande och tidigt progression i mänsklig glaukom.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.
Puller | Narishige | PC-10 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C. |
Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
25 mL serological pipet | Costar | 4489 | |
Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
P1000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
Microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690 | |
P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
0.2 mL PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
Ketamine | Controlled substance | ||
Xylazine | Bayer Healthcare | ||
Acepromazine | Vetoquinol | ||
U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
Balance | Ohaus | CS 200 | |
Buprenorphine | Controlled substance | ||
Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
Dissection tools | |||
Small brush | |||
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
Aluminum foil | |||
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |