Her presenterer vi en protokoll for å indusere okulær hypertensjon hos mus øyet som resulterer i tap av gangliecelle som observert i glaukom. Magnetiske mikroperler som injiseres i fremre kammer og tiltrukket av iridocorneal vinkel ved hjelp av en magnet for å blokkere utløpet av kammervann.
Bruken av gnager modeller av glaukom har vært avgjørende for å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn patofysiologien av denne multifaktoriell nevrodegenerativ sykdom. Med bruk av en rekke transgene mus linjer, er det økende interesse for induserbare murine modeller av okulær hypertensjon. Her presenterer vi en okklusjon modell av glaukom, basert på injeksjon av magnetiske mikroperler inn i det fremre kammer av øyet ved hjelp av en modifisert Microneedle med en fasettert skråkant. De magnetiske mikroperler er tiltrukket av iridocorneal vinkel ved hjelp av en håndholdt magnet for å blokkere drenering av kammervann fra fremre kammer. Dette avbrudd i vandige dynamiske resulterer i en jevn økning av intraokulært trykk, som senere fører til tap av gangliecelle, som observert i humane pasienter glaukom. Mikroperlens okklusjon modell presentert i dette manuskriptet er enkle i forhold til andre induserbare modeller av glaukom og også høyteffektiv og reproduserbar. Viktigere, modifikasjonene som presenteres her minimalisere vanlige problemer som ofte oppstår i okklusjon modeller. Først, ved bruk av en skrå glass Microneedle hindrer tilbakestrøm av mikroperler, og sikrer at minimal skade oppstår på hornhinnen i løpet av injeksjonen, og dermed redusere skaderelaterte effekter. For det andre sikrer bruken av magnetiske mikroperler evnen til å tiltrekke seg de fleste perler til den iridocorneal vinkel, effektivt redusere antall perler som flyter i det fremre kammer unngå kontakt med andre strukturer (f.eks., Iris, linse). Endelig tillater bruk av en håndholdt magnet fleksibilitet ved håndtering av små mus øyet til effektivt å lede de magnetiske mikroperlene og sikre at det er lite tilbakeløp av mikroperlene fra øyet når den Microneedle trekkes tilbake. Oppsummert mikroperlens okklusjon musemodell som presenteres her er en kraftig undersøkende verktøy for å studere nevrodegenerative endringer som skjer i løpet av utbruddet og progresjon av Glaukoma.
Grønn stær er en progressiv og irreversibel blendende tilstand som vil påvirke anslagsvis 80 millioner mennesker verden over i 2020 en. I glaukom pasienter, er synstap forårsaket av selektiv død gangliecelle (RGCs), utgangs nevroner som sender visuell informasjon fra netthinnen til hjernen. Grønn stær er en aldersrelatert nevrodegenerativ sykdom med mange risikofaktorer som den vanligste er forhøyet intraokulært trykk (IOP). Faktisk er IOP den eneste modifiserbar risikofaktor i glaukom og nåværende behandlinger fokusere utelukkende på styring trykk i øyet. Men flere genetiske, cellulære, og miljøfaktorer påvirker utbruddet og progresjon av denne sykdommen. Derfor forstå de forskjellige mekanismer som til slutt bidrar til neuronal død er viktig å utvikle effektive behandlinger for glaukom.
Dyremodeller av glaukom er viktig å studere sykdom patofysiologi og å identifisere og testelovende behandlingsformer. Den økende tilgjengeligheten av transgene mus linjer inkludert betingede knockout stammer og mus som bærer genetisk kodet fluorescerende tracere har drevet behovet for induserbare murine glaukom modeller. Flere gnager modeller av glaukom har blitt utviklet gjennom årene (anmeldt i 2,3). I mange av disse modellene, er glaukom indusert ved å forstyrre kammervæskedynamikk, noe som resulterer i heving av IOP. Okklusjon modeller, der mikroperler eller andre stoffer injiseres inn i fremre kammer av øyet for å blokkere vandig drenering, har vunnet popularitet de siste årene delvis på grunn av sin relativt enkelt å øke IOP 4-14.
Mikroperlens okklusjon modell av glaukom, først gjennomført i primater 12, kaniner og rotter 8, 4,9,11, ble nylig tilpasset for bruk i mus 5,6,10. I disse studiene var intracameral injeksjon av polystyren-mikroperler, alene eller ikombinasjon med et viskoelastisk materiale, resulterte i IOP høyde som fører til etterfølgende RGC døden 6,10. Imidlertid, tilbakeløps når nålen trekkes ut av øyet og løsner mikroperler fra iridocorneal vinkel er vanlige problemer som oppstår under prosedyren. For å minimalisere disse ulempene, har magneter blitt brukt for å tiltrekke seg de magnetiske mikroperlene til iridocorneal vinkelen på øyet 4,9.
Protokollen er beskrevet her er en modifisert prosedyre basert på tidligere studier 9,10 som bruker magnetiske mikroperler og en håndholdt magnet innrettet til muse øyet (figur 1). Flere viktige modifikasjoner har blitt innført i vår protokoll for å sikre effektiv og reproduserbar IOP økning i mus. Først er injeksjon av mikro gjøres ved hjelp av en nøye utarbeidet glass Microneedle med et fasettert skråkant. De resulterende glatte overflater av Microneedle så vel som dets spisse tuppen sikrer at minimal skade erpåført som det punkterer hornhinnen. Bruken av dette glass Microneedle resulterer også i økt kontroll når Microneedle spissen går inn i fremre kammer, og dermed redusere risikoen for å skade nærliggende strukturer som iris og linsen. I tillegg forenkler den lille injeksjon lesjon hornhinneselv reparasjon og reduserer uønskede skaderelaterte effekter.
Sekund, injeksjon av magnetiske mikroperler og bruk av en håndholdt magnet tillate nøyaktig kontroll for å tiltrekke seg kulene til iridocorneal vinkel i små mus øyet. Magnetiske mikroperler som er 4,5 mikrometer i diameter ble brukt fordi denne mikrostørrelse ikke tilstopper forberedt Microneedle åpning og viktigere, når injisert, disse mikro effektivt blokkert drenering av kammervann. Denne tilnærmingen reduserer ikke bare tilbakeløp av de injiserte mikroperler, men sikrer også at et maksimalt antall av mikroperler samler seg i målområdet for å effektivt blokkere vandig humor drenering. furthermore, denne strategien reduserer også antall perler som fløt i fremre kammer unngå kontakt med andre strukturer, slik som iris og linsen, og hindrer passasjen til bakre kammer. Sammen er disse endringene sørge for at mikroinjeksjons operasjonen er utført med relativ letthet og på en riktig måte som resulterer i en svært reproduserbar, effektiv og varig induksjon av okulær hypertensjon hos mus.
Videoen teknikken som presenteres her gir detaljerte steg-for-steg instruksjoner om hvordan du utfører intracameral injeksjon av magnetiske mikro å effektivt og reproduserbart indusere IOP heving i mus. Denne prosedyren resulterer i vedvarende IOP økning som ikke krever ytterligere injeksjoner og fremmer påvisbare RGC soma og axon tap i løpet av de første 3 ukene av okulær hypertensjon induction.Elevated IOP er en viktig risikofaktor for utvikling av glaukom hos mennesker. Derfor er dette et verdifullt murin okulær hypertensjon avhengig glaukom modell som har potensial for et bredt spekter av applikasjoner.
En vanlig ulempe i forbindelse med injeksjon av mikroperler inn i det fremre kammer er knyttet til å perle tilbakeløp gjennom injeksjonsstedet når nålen er trukket tilbake, noe som ofte resulterer i bare delvis obstruksjon av vandig strøm, og økt variasjon. For å løse dette problemet, ble flere viktige endringer implementert. Firs t, forsiktig fremstilling av en ren, skarp glass Microneedle med et fasettert skråkant er en forutsetning for en vellykket injeksjon av mikroperlene. Et riktig fremstilt Microneedle muliggjør kontrollert og jevn penetrering av hornhinnen med minimal anvendelse av trykk til den skjøre okulære overflaten. Den lille hornhinnen punktering forhindrer tilbakestrømning av mikroperler. I tillegg reduserer den fine Microneedle risiko for skader på nærliggende strukturer som iris og linsen, noe som kan resultere i ikke-sykdom relatert betennelse. For det andre, anvendelse av en håndholdt magnet til strategiske okulære områder under og etter injeksjonen er et annet viktig aspekt ved denne teknikken. I løpet av injeksjonen, blir magneten brukes til å trekke de magnetiske mikroperlene til den fremre kammer hindre tilbakeløp av mikroperlene når Microneedle trekkes tilbake. Etter injeksjonen blir magneten så brukt til å dirigere mikroperlene til iridocorneal vinkel for å blokkere vandig humor utstrømning.
telt "> Et annet problem som ofte oppstår i mikro okklusjon modeller er at gjentatte kule injeksjoner er ofte nødvendig for å oppnå varig IOP høyde 10,11. Dette kan være et resultat av mikroperler løsner fra iridocorneal vinkel med tiden. Kombinasjonen av en håndholdt magnet, som beskrevet ovenfor, og posisjoneringen av mus postoperativt i stor grad forbedrer resultatet. bruken av injiserbare bedøvelsesmidler, som tillater fleksibilitet til å bevege hodet i løpet av prosedyren og krever en lengre postoperativ restitusjonsperiode, er foretrukket. plassering av mus med det opererte øyet vendt oppover for et par timer etter operasjonen bidrar til oppgjør av mikroperler på iridocorneal vinkel og reduserer risikoen for omplassering tilbake i fremre kammer.Sikre at antall injiserte perler er relativt konsekvent er et annet viktig skritt for å minimere interdyre variasjoner. Siden mikro bosette på bottom av røret, er det nødvendig å fullt homogen mikroperlens løsning og ta ut riktig volum inn i Microneedle på en riktig måte. Injeksjon av færre perler inn i fremre kammer kan resultere i ufullstendig blokkering av de vandige humor drenering strukturer, noe som sannsynligvis vil resultere i dårlig eller variabel IOP høyde. Av notatet, selv om det endelige formålet med mikroinjeksjons er å heve IOP, forsiktighet bør tas når IOP målinger fra våken mus er høyere enn toppverdiene rapportert i denne studien (~ 25 mmHg). Ekstremt høye IOP øke risikoen for iskemisk skade og kan også forårsake smerte for dyret. Høyden av IOP bør vurderes som en av mange faktorer å vurdere hvor vellykket operasjonen. Som sådan bør resultatet av fremgangsmåten måles basert på flere parametere inkludert IOP høyde, RGC soma død, og axon tap.
Selv protokollen som er beskrevet her resulterer i de fleste mikroperler vellykkedely settling på vinkelen, en potensiell begrensning av denne modellen er at disse perler som forblir flytende i fremre kammer kan forstyrre med levende retinal bildebehandling gjennom hornhinnen, samt elektrofysiologiske eller atferdsmessige analyser som krever effektiv passasje av lys. Et annet viktig aspekt å vurdere når utnytte denne mikro okklusjon modellen er at omfanget av IOP heving og påfølgende RGC degenerasjon varierer med alder og genetisk bakgrunn av det opererte mus [4]. Derfor vil omfanget av IOP høyde og tids av RGC degenerasjon må bestemmes for hver enkelt transgen muselinje og / eller aldersgruppe.
Et trekk ved denne modellen er at forhøyet IOP fører til gradvis tap av RGC død i løpet av de tre første ukene etter mikroinjeksjon, og betydelig RGC død blir oppdaget på 3 uker etter inngrepet. Derfor gjør denne modellen undersøkelse av tidlige og / eller subtile endringer som oppstår i denne disease, før utilslørt RGC soma og axon tap. ble det ikke observert en betydelig økning i RGC død mellom 3 og 6 uker etter induksjon av okulær hypertensjon. Faktisk, forble RGC soma og axon tapet stabilt på ~ 22-25% mellom 3 og 6 uker til tross for vellykket og vedvarende IOP høyde på følgende tidspunkter. En lengre varighet av vedvarende IOP kan være nødvendig for ytterligere RGC tap å skje i C57BL / 6 mus, som synes å være mer motstandsdyktig mot RGC skade enn andre musestammer. 5 Ytterligere modifikasjoner til protokollen som presenteres her, herunder tilpasning av perle størrelse og ytterligere injeksjoner kan være nødvendig å studere RGC tap på senere tidspunkter. Derfor er vår protokoll ideell for studier fokusert på tidlig patofysiologiske endringer som korrelerer med beskjedne RGC nevrodegenerasjon som er relevante for utbruddet og tidlig progresjon i menneskelig glaukom.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.
Puller | Narishige | PC-10 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C. |
Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
25 mL serological pipet | Costar | 4489 | |
Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
P1000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
Microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690 | |
P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
0.2 mL PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
Ketamine | Controlled substance | ||
Xylazine | Bayer Healthcare | ||
Acepromazine | Vetoquinol | ||
U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
Balance | Ohaus | CS 200 | |
Buprenorphine | Controlled substance | ||
Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
Dissection tools | |||
Small brush | |||
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
Aluminum foil | |||
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |