JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

Published: March 03, 2016
doi:
10.3791/53732
,
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases,Nationwide Children’s Hospital

Summary

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Abstract

“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Introduction

وحددت "القسيم" الكلاسيكي كما مناطق إعادة التركيب الانتصافي قمعت في مجال علم الوراثة واعترف فيما بعد انقباض الأساسي من الكروموسومات الإنقسامية، والتي تلعب دورا أساسيا في فصل كروموسوم دقيقة أثناء الانقسام. وصفت "Kinetochores" مثل الهياكل متعددة الطبقات التي ترتبط الأنابيب الدقيقة على سطح القسيم، كما يتضح من المجهر الإلكتروني. تم تعريف "kinetochores" فيما بعد باسم معقد جزيء أن يموضع في السنترومير من الكروموسومات الإنقسامية. وعلى الرغم من الاختلاف الكبير في تسلسل الحمض النووي القسيم المركزي بين الفقاريات، هيكل الحيز الحركي والتكوين يتم حفظها للغاية. مطلوب التفاعل الديناميكي بين ميكروتثبول المغزل والحيز الحركي للفصل المؤمنين من الصبغيات أثناء الانقسام، والعيوب في السنترومير-الحيز الحركي وظيفة يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات وبالتالي السرطان.

السنترومير في معظم حقيقيات النوىلا يوجد لديه تسلسل الحمض النووي محددة، ولكن يتكون من صفائف كبيرة (0،3-5 ميجا بايت) من الحمض النووي alphoid المتكررة التي تتكون من 171-BP الحمض النووي α قنوات فضائية. إلا في مهدها الخميرة، ويتحقق هوية السنترومير وليس عن طريق تسلسل الحمض النووي ولكن من خلال وجود جسيم نووي الخاصة التي تحتوي على هيستون H3 البديل CenH3 (السنترومير البروتين A [CENP-A] في البشر). 5 CENP-A جسيم نووي توطين ل لوحة الداخلية kinetochores الثدييات 7 و ربط على الحمض النووي α-الأقمار الصناعية 171-BP. تتطلب القسيم النشطة CENP المحتوية على وجسيم نووي لتوجيه توظيف شبكة التأسيسية المرتبطة السنترومير (CCAN) والبروتينات الحيز الحركي، التي تنظم معا المرفق من الكروموسومات إلى المغزل الإنقسامية وتقدم دورة لاحقة عبر حاجز المغزل.

في ضوء الأدلة أعلاه، فقد اقترح CENP-A ليكون علامة جينية من السنترومير 8؛ ومع ذلك، فإن العملية التي يتم تضمينها CENP-A طn لالحمض النووي القسيم المركزي والعوامل المسؤولة عن هذا التأسيس حتى الآن لم يتم توصيفه جيدا. ونطاق استهداف السنترومير قصيرة (CATD) يقيم في هيستون أضعاف منطقة CENP-A، واستبدال المنطقة المقابلة من H3 مع CATD كافية لH3 المباشر إلى السنترومير، واقترحت 9 دراسات عدة أدوار وظيفية لمرحلة ما بعد متعدية تعديل (PTM) من CENP-A 12-16. ومع ذلك، لم يتم بعد إجمال الآليات الجزيئية لهذه PTMs من CENP-A في التوظيف لالقسيم. ذكرنا سابقا أن CUL4A-RBX1-COPS8 E3 النشاط يغاز مطلوب للCENP-A K124 ubiquitylation وتوطين CENP-A إلى القسيم 17

وقد أدى اكتشاف وتوصيف البروتينات الحيز الحركي إلى رؤية جديدة بشأن العزل الصبغي. وقد تم تحديد 18 أكثر من 100 من عناصر الحيز الحركي في خلايا الفقاريات التي كتبها نهج مختلف. 19،20 وكيلمكانة كيفية تجميع kinetochores وظيفة تأتي أيضا من توصيف الوظائف الخلوية من كل شبكة البروتينات الحيز الحركي-السنترومير والبروتين البروتين داخل الخلايا. 19 التصور المباشر والتصوير المتقدمة الأساليب في مضان المجهري توفر قرار ملحوظا من مكونات السنترومير الحيز الحركي وتسمح الملاحظة المباشرة من مكونات جزيئية معينة من القسيم وkinetochores. وبالإضافة إلى ذلك، أساليب مناعي غير مباشر (معهد التمويل الدولي) تلطيخ باستخدام أجسام مضادة محددة ذات أهمية حاسمة لهذه الملاحظات. ومع ذلك، على الرغم من العديد من التقارير حول بروتوكولات معهد التمويل الدولي، وعدد قليل مناقشتها في مشاكل التفاصيل بروتينات معينة، السنترومير الحيز الحركي 1-4 وهكذا، وتطوير وسائل معهد التمويل الدولي تلطيخ وفحص معهد التمويل الدولي الكمي التقارير إلى تحليل تحديدا كل من البروتين السنترومير الحيز الحركي أمر مهم للغاية. في معهد التمويل الدولي تلطيخ، ينبغي للمرء أن المضي قدما في بروتوكول تلطيخ لتجنب فقدان البروتين في المصالح أوبقية الخلية. ومع ذلك، تثبيت يدمر مواقع المستضدات في بعض الأحيان، ومختلف مجموعات الضد مستضد عمل سيئة مع تثبيتي واحد، ولكن بشكل جيد جدا مع آخر، 21 واختيار تثبيتي يعتمد إلى حد كبير على البروتين (ق) من الفائدة. لذلك، وأساليب مختلفة تثبيتي حاسمة في تلطيخ معهد التمويل الدولي من البروتينات السنترومير الحيز الحركي.

وقد تم تطوير أساليب هنا الأمثل للمناعي غير مباشر (معهد التمويل الدولي) تلطيخ ومقايسة لمعالجة توطين البروتينات السنترومير الحيز الحركي الذاتية، بما في ذلك CENP-A والعلم الموسومة الخارجية البروتينات CENP-A، والكميات من هذه البروتينات في الخلايا البشرية. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحليل البروتينات السنترومير الحيز الحركي في الأنواع الأخرى.

Protocol

1. خلية الثقافة وترنسفكأيشن وضع غطاء زجاجي (22 ملم × 22 ملم) في لوحة البوليسترين 6 جيدا. معطف اختياريا غطاء زجاجي مع بولي-L-ليسين، 0.1٪ ث / ت، في الماء (انظر قائمة المواد / المعدات) للحفاظ على الخلايا الإنقسامية على الزجاج غطاء…

Representative Results

التحليل المناعي من الذاتية CENP-A تدعم الفرضية القائلة بأن هناك حاجة CUL4A-E3 يغاز لتوطين CENP-A إلى القسيم وأظهرت لنا الدراسات الحديثة أن CUL4A-RBX1-COPS8 E3 النشاط يغاز مطلوب للubiquitylation من ليسين 124 (K124) على CENP-A وتوطين CENP-A إلى القسيم. 17 في البداية، ت…

Discussion

في السنوات الأخيرة قد وضعت العديد من الدراسات المختلفة المقايسات المجهر الكمي للخلايا ثابتة. 42 التقدم في علم الأحياء السنترومير-الحيز الحركي وغالبا ما يتطلب فهم وظيفة السنترومير محددة أو الحيز الحركي محددة من البروتينات التي التحت خلوية تنظيم المكانية والزم?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM68418.

Materials

Lipofectamin 2000 Life Technologies/Invitrogen 11668 transfection reagent I
Lipofectamin RNAiMAX Life Technologies/Invitrogen 13778 transfection reagent II
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water 
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)  Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm) 
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well polystyrene plate 
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
PAP PEN  Binding Site AD100.1 Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining)
Paclitaxel (Taxol) SIGMA-SLDRICH T7402 Taxol for mitotic cell analysis
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) Enzo Life Sciences BML-T120 TN16 for mitotic cell analysis
BSA (bovine serum albumin) SIGMA-SLDRICH A7906 Blocking reagent
Triton X-100 SIGMA-SLDRICH T8787 Detergent for permeabilization
Paraformaldehyde SIGMA-SLDRICH P6148 Fixation reagant
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides 
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation)
Anti-CENP-B antibody  abcam ab25734 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation)
Anti-centromere antibody (ACA) Fitzgerald Industries International, Inc. 90C-CS1058 Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H antibody Bethyl Laboratories BL1112 (A400-007A) Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H antibody BD 612142 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)
Anti-CENP-I antibody N/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi Kitagawa Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anti-KNL1 antibody Novus Biologicals NBP1-89223 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibody Novus Biologicals / GeneTex NB 100-338 / GTX70268 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibody GeneTex GTX110735 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Ska1 antibody abcam ab46826 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Flag antibody SIGMA-ALDRICH F3165 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-Flag antibody SIGMA-ALDRICH F7425 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A antibody N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1 antibody Cell Signaling 4397 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH antibody Chemicon MAB374 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11001 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11012 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Skim milk
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope  Leica motorized fluorescence microscope 
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X oil immersion lens
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X oil immersion lens
Leica EL6000 compact light source Leica External compact light source for fluorescent excitation
ORCA-R2 Digital CCD camera  Hamamatsu C10600-10B digital CCD camera 
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software  Perkin Elmer/Improvision For image observation, acquisition, quantification, and analysis
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software  Perkin Elmer/Improvision For image observation, acquisition, quantification, and analysis
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001/11836170001 Protease inhibitor cocktail tablets
PlusOne 2-D Quant Kit Amersham Biosciences 80-6483-56 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS)
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Immobilon-FL EMD Millipore IPFL00010 PVDF membrane for transferring
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG LI-COR Biosciences 926-32210 IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG LI-COR Biosciences 926-32221 IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 Fisher Scientific PI35507 DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-Rabbit DyLight 649 Fisher Scientific PI35565 DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz SC-2005 HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF)
Goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz SC-2004 HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software  Improvision/PerkinElmer Software A
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer Software B2
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc.  33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc.  33996-185 Microtip for sonication
Odyssey CLx Infrared imaging System  LI-COR Biosciences Infrared imaging system for immunoblot detection
Image Studio Analysis Software Ver 4.0  LI-COR Biosciences Software C
Molecular Imager Versadoc MP4000 System  Bio-Rad Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Quantity One 1-D analysis software  Bio-Rad Software D
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N., Grainger, D. . The Proteintech Blog.Proteintech. , (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. . HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR?. Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere–kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H., Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137 (2014).
  57. Oliver, C., Rapely, R., Walker, J. M. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. , 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R., Vo-Dinh, T. u. a. n. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. , 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. . Fluorescence bleed-though. , (2011).

Tags

ImmunofluorescenceEndogenousExogenousCentromere-kinetochore ProteinsCENP-ACell CultureTransfectionFixationPermeabilizationAntibody LabelingMicroscopy
check_url/53732?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. J. Vis. Exp. (109), e53732, doi:10.3791/53732 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image