Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).
“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.
"sentromerer" ble klassisk definert som områder av undertrykt meiotisk rekombinasjon i genetikk og senere anerkjent som den primære innsnevring av mitotiske kromosomer, som spiller en viktig rolle i nøyaktig kromosom segregering under mitose. "kinetochores" ble beskrevet som den multilagsstrukturer som binder seg til mikrotubuli ved overflaten av sentromerer, som vist ved elektronmikroskopi; "kinetochores" ble senere definert som macromolecular kompleks som lokaliserer på cent av mitotiske kromosomer. Til tross for en dramatisk divergens av centromeric DNA-sekvenser blant virveldyr, kinetochore struktur og sammensetning er sterkt konservert. En dynamisk samspill mellom spindel mikrotubuli og kinetochore er nødvendig for trofast segregering av kromosomer under mitose, og defekter i cent-kinetochore funksjon fører til Aneuploidy og dermed kreft.
Cent i de fleste eukaryoterhar ingen definert DNA-sekvens, men er sammensatt av store matriser (0.3-5 MB) med repeterende alphoid DNA bestående av 171-bp α-satellitt-DNA. Bortsett fra i spirende gjær, er cent identitet oppnås ikke av DNA-sekvensen, men ved tilstedeværelsen av en spesiell nucleosome som inneholder histon H3 varianten CenH3 (cent Protein A [CENP-A] i mennesker). 5 CENP-A nukleosomer lokalisere til indre plate av pattedyr kinetochores 7 og binde seg til 171-bp α-satellitt DNA. Aktive sentromerer krever CENP-A-holdig nukleosomer til direkte rekruttering av et konstituerende cent-forbundet nettverk (ccan) og kinetochore proteiner, som sammen regulere feste av kromosomene til mitotisk spindel og påfølgende syklus progresjon gjennom spindel sjekkpunkt.
I lys av det ovenstående bevis har CENP-A blitt foreslått å være den epigenetisk merket på cent 8; imidlertid, den prosessen som CENP-A er inkorporert into centromeric DNA og de faktorer som er ansvarlige for dette inkorporering ennå ikke er godt karakterisert. En kort cent-målsøkende domene (CATD) befinner seg i den histon fold region av CENP-A, og erstatning av det tilsvarende område av H3 med CATD er tilstrekkelig til direkte H3 til cent. 9. Flere studier antydet funksjonelle roller for post-translasjonell modifikasjon (PTM) av CENP-A 12-16; Men de molekylære mekanismene for disse PTMs av CENP-A i rekrutteringen til sentromerer ennå ikke er klarlagt. Vi har tidligere rapportert at CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase aktivitet er nødvendig for CENP-A K124 ubiquitylation og lokalisering av CENP-A til sentromerer. 17
Oppdagelsen og karakterisering av kinetochore proteiner har ført til ny innsikt om kromosom segregering. 18 Mer enn 100 kinetochore komponentene har blitt identifisert i virveldyrceller ved ulike tilnærminger. 19,20 En understående av hvordan kinetochores montere og funksjon kommer også fra karakteriseringen av de cellulære funksjoner av hver cent-kinetochore proteiner og protein-protein-nettverket i cellene. 19 direkte visualisering og avansert avbildningsmetoder i fluorescens mikroskopi gir bemerkelsesverdig oppløsning av cent-kinetochore komponenter og tillate direkte observasjon av spesifikke molekylære komponenter av sentromerer og kinetochores. I tillegg er fremgangsmåter for indirekte immunfluorescens (IIF) farging ved hjelp av spesifikke antistoffer er avgjørende for disse observasjonene. Men til tross for mange rapporter om IIF protokoller, få diskutert i detalj problemer med spesifikke cent-kinetochore proteiner. 1-4 Dermed utvikle og rapportering metoder for IIF flekker og en kvantitativ IIF analyse for å spesifikt analysere hver cent-kinetochore protein er ekstremt viktig. I IIF farging, bør man fortsette med fargingen protokollen for å unngå tap av proteinet av interesse ellerresten av cellen. Imidlertid ødelegger fiksering antigene seter fra tid til annen, og forskjellige antistoff-antigen kombinasjoner fungerer dårlig med en fikseringsmiddel, men svært godt med hverandre, 21 og valg av bindemiddel avhenger i stor grad av protein (er) av interesse. Derfor ulike festing metoder er avgjørende i IIF farging av cent-kinetochore proteiner.
Her optimaliserte fremgangsmåter for indirekte immunfluorescens (IIF) farging, og en analyse for å adressere lokalisering av endogene cent-kinetochore proteiner, inkludert CENP-A og Flagg-merkede eksogene CENP-A-proteiner, og kvantifisering av disse proteiner i humane celler har blitt utviklet. Disse metodene kan brukes til analyse av cent-kinetochore proteiner i andre arter.
I de senere år har mange studier har utviklet ulike kvantitative mikroskopi-analyser for fikserte celler. 42 Progress in cent-kinetochore biologi krever ofte en forståelse av den centspesifikk eller kinetochore-spesifikk funksjon av proteiner som subcellulære romlig-temporale regulering reflekterer de endrede funksjoner av disse proteinene i løpet av cellesyklusen. Derfor, her vi utviklet metoder for IIF farging og en kvantitativ IIF-analyse for spesifikt å analysere de relative nivåer av endogene og ek…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend GM68418.
Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |