Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate ¹⁸O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

Op het gebied van proteomica, filter geholpen monstervoorbereiding (FASP) is wijd op zijn vermogen om de hoeveelheid uitgangsmateriaal minimaliseren monstervoorbereiding artefacten te verminderen en te maximaliseren monsterdoorvoer ¹ aangenomen. Echter dergelijke werkwijze nog ontstaan ​​en grip te krijgen op het gebied van glycomics. Ontwikkeling van high-throughput, zijn kwantitatieve workflows nodig vanwege de integrale rol van glycosylering in biologische verdediging en de modulatie door kanker of ziekten ^2,3. Bij zoogdieren worden N-glycanen samengesteld uit zich herhalende saccharide eenheden (hexosen (Hex), hexosamines (HexNAc) siaalzuren (NeuAc) en fucoses (Fuc)), die een kernstructuur versieren (Hex ₃ HexNAc ₂₎ ⁴ covalent gebonden asparagine. Hoewel de glycospace aanzienlijk groot als isomeren worden geteld (> 10 ^12), is vrij klein op een samenstelling basis en molecuulgewichten gewoonlijk variëren van 1,000-8,000 Da ^{5 <}/ Sup>. De samenstelling homogeniteit van de klasse en de hydrofiliciteit van glycanen vormen unieke uitdagingen voor zuivering, scheiding en massaspectrometrie (MS) werkstromen ^6.

Traditioneel worden N-glycanen geknipt van eiwitten of peptiden met peptide N -glycosidase F (PNGase F) en vervolgens verrijkt door lectine-affiniteitschromatografie ^7, gefotografeerd door hydrazide kralen ⁸ of gezuiverd door vastefase-extractie (SPE) ^9,10. Hoewel deze methoden zijn zeer effectief, ze introduceren extra stappen voor ontzouting en beperken het aantal monsters tegelijkertijd verwerkt. In de afgelopen tien jaar hebben een aantal high-throughput platform voor glycomics voorgesteld. Kim et al. Publiceerde een semi-automatische methode waarbij een vacuümgestuurde, SPE 96-well plaat ^11. Als alternatief kan een methode affiniteit-filter (N -glyco-FASP) werd ontwikkeld door de Mann-groep, die de oorspronkelijke derivatisering van de fi vereistefilter met een samenstelling van ¹² lectinen. Tenslotte stelt het Thomas-Oates groep een semi-kwantitatieve methode, het filter Geholpen N-glycan Separation (HOEKTANDEN), waarbij de samenstelling smalle afmeting van de glycospace ¹³ benut. Zich baserend op moleculair gewicht cut-off filters, werden kleine verontreinigingen eerst gewassen te verliezen en daarna werden de N-glycanen verteerd en uitgewassen. Gedeglycosyleerde eiwitten blijven op de filter in dit protocol en kan worden onderworpen aan in-line FASP.

Identificatie en kwantificering van glycanen door electrospray ionisatie (ESI) MS vereist off-line scheidingen voor (gedeeltelijke) oplossing van isomeren en derivatisering voor detectie van lage-voorkomende soort. Etikettering in de individualiteit wanneer normaliseren met glycan hydrazide labels strategie verleent compatibiliteit met reverse-fase-vloeistofchromatografie (RPLC) ^14,15. Het 4-fenethyl-benzohydrazide (P2PGN) hydrofobe tag bemiddelt de hydrofiliciteit van de glycanen, enhancing ionisatie van gemiddeld vier keer ^16. Hoewel andere technieken, zoals permethylation ¹⁷ of amine-reactieve tagging chemie ^18, bieden soortgelijke voordelen, in het hydrazide reactie glycanen omgezet 1: 1 stoichiometrisch in gemakkelijke omstandigheden. Relatieve kwantificering bereikt door tandem analyse van monsters gederivatiseerd met natief (NAT) of ¹³ C ₆ stabiele isotooplabels (SIL).

De volgende methode evolueert HOEKTANDEN voor plasma-toepassingen en koppels naar de P2GPN hydrofobe tag voor nauwkeurige relatieve kwantificering. Bovendien werd ontworpen om jachtgeweer proteomics, deamidering profielen en kwantitatieve glycomics voeren op een enkele portie van het monster, zonder de integriteit van de analyses.

Protocol

1. Eiwit en glycoproteïne Denaturation en Alkylering Voor standaard preparaten, belasting 2,5 ui van een 0,1 ug / ul oplossing van glycoproteïne (bijv Fetuin of RNase B) op een 30 kDa of 10 kDa moleculair gewicht (MW) cut-off filter. Voor biologische plasma monsters, controleer dan de eiwitconcentratie door een standaard Bradford 19 of bicinchoninezuur 20 (BCA) proteïne test. Verdun het plasma, indien nodig, met 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH 4 HCO 3) in H2O (PNGase Digest Buffer) bij een pH van ~ 7 dat tussen 10-100 mg / ml totaal eiwit. Load 2,5 gl plasma (25-250 ug eiwit) op een filter. Opmerking: Dit protocol is alleen plasma van bloedmonsters verzameld in aanwezigheid van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) getest. Voeg 2 pl 1 M oplossing Dithiothreitol (DTT) aan elk monster in het filter. Verdun het monster met 200 ul PNGase verteren buffer. Cap het filter monsterbus en licht vortex, zorg dat u de filter van zijn plaats niet te verstoren. Incubeer het monster bij 56 ° C gedurende 30 minuten om de eiwitten te denatureren en glycoproteïnen. Om de monsters te alkyleren, voeg 50 ul 1 M joodaceetamide, tot een uiteindelijke concentratie van ~ 200 mM, en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten. LET OP: Als proteomics analyse niet gewenst is, kan stap 1.5 worden overgeslagen. Concentreer het gedenatureerde glycoproteïne op het filter door centrifugeren monsters bij 14.000 xg gedurende 40 min. Gooi doorstromen. 2. N-gebonden Glycan enzymatische afbraak Was het monster met 100 ui buffer PNGase verteren. Concentreer het glycoproteïne op het filter bij 14.000 xg gedurende 20 min en gooi doorstromen. Herhaal het wassen en concentreren stap tweemaal voor een totaal van drie keer, waardoor een concentraat in het filter dode volume (~ 5 pl). gooi alledoorstromen. Teruggooi collectie flacon eenmaal wast zijn voltooid. Verzamel alle toekomstige elutiemiddelen en wast in een nieuwe collectie flacon. OPMERKING: PNGase verteren in buffer H 2 18 O tijdens het PNGase F vertering stap voor stabiele isotoop labeling van de geglycosyleerde asparagine-sites, die chemisch gedeamideerde aangestoken kunnen worden gebruikt. Voeg 2 ul van glycerol-vrije PNGase F (x 75.000 eenheden / ml) te filteren na het overbrengen naar een nieuwe verzameling flesje. Voeg 98 gl buffer PNGase verteren, waardoor de totale volume op 100 pl, en voorzichtig pipet op en neer op het filter te mengen. Enzymatisch verteren de glycanen onder de voorwaarden in de stappen 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OR. OPMERKING: Drie werkwijzen voor de deglycosylatie van eiwitten kunnen worden gebruikt. Voor uitsluitend glycomics analyse (geen proteomics), wordt de lange incubatietijd in stap 2.2.1 aanbevolen. Voor glycomics en proteomics onderzoek, de stappen 2.2.2 en 2.2.3 zal een hoge kwaliteit peptiden met minimale niet-specifieke deamidering. Glycomics alleen digestie protocol (18hr) Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 18 uur enzymatisch splitsen alle N-glycanen. Spike-vertering protocol (SPI): Incubeer monsters bij 50 ° C gedurende 2 uur. Snel te werken, te verwijderen monsters en piek in een extra 2 ui glycerol-vrije PNGase F (x 75.000 eenheden / ml). Licht vortex de monsters gedurende 1-2 sec te mengen. Incubeer de monsters bij 50 ° C gedurende nog 2 uur. Microgolfontsluiting protocol (MD): Leg monsters in een microcentrifugebuis drijvend rek. Vlotter monsters in een 1 L beker gevuld met 1 liter gedeïoniseerd (DI) water. Plaats het bekerglas in het midden van een magnetron (950 W) met een roterende plaat. Magnetron op 60% vermogen (570 W) gedurende 5 min. Afkoelen verwijderen monsters houdt bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. magnetron vervolgens gedurende nog 5 min bij 60% vermogen. LET OP: Magnetron energie-instellingen zal moeten worden aangepast op basis van het maximale vermogen van de magnetron.Gemiddeld vermogen moet constant tussen de modellen worden gehouden. 3. Elutie van N-glycanen Elueer glycanen door centrifugeren van het monster bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 20 ° C. Voeg 100 ul PNGase verteren buffer om het filter en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 20 ° C. Collect wash bevattende resterende N-gebonden glycan in dezelfde verzameling flacon als elutiemiddel. Herhaal dit twee keer. Verwijder filter en plaats in de nieuwe collectie flacon. Incubate glycan monsters in de -80 ° C vriezer tot bevroren (30-60 min). Droge voltooid, bij kamertemperatuur, onder vacuüm concentrator (4-6 uur). OPMERKING: N-glycanen kunnen worden bewaard bij -20 ° C tot zes maanden voor derivatisering. 4. Eiwit FASP Spijsvertering LET OP: Als proteomics of deamidering siteanalyse niet gewenst is, kan deel 4 van het protocol worden overgeslagen. Spoel tHij filter met het gedeamideerde peptiden met 400 gl 8 M ureum buffer. Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen. Concentreren op de filter bij 14.000 xg gedurende 15 min. Gooi alle doorstroom. Herhaal stap 4.1 nog tweemaal voor een totaal van drie wassingen ureumbuffer. Spoel de filter met het gedeamideerde peptiden met 400 gl 2 M ureum, 10 mM CaCl2 buffer (trypsinedigest buffer). Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen. Concentreren op de filter bij 14.000 xg gedurende 15 min. Gooi alle doorstroom. Herhaal stap 4.1 nog tweemaal voor een totaal van drie wassingen trypsinedigestie buffer. Teruggooi collectie flacon eenmaal wast zijn voltooid. Verzamel alle toekomstige elutiemiddelen en wast in een nieuwe collectie flacon. Voeg 50 ul van varken gemodificeerd trypsine in een 1:50 of 1: 5 trypsine: eiwit (w / w) respectievelijk ratio voor ontdekking of kwantitatieve proteomics experimenten.Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen. Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 2 uur. Snel te werken, te verwijderen samples en piek in een extra 50 ul van trypsine aan de 1:50 of 1: 5 trypsine: eiwitverhouding. Licht vortex de monsters gedurende 1-2 sec te mengen. Incubeer de monsters bij 50 ° C gedurende nog 2 uur. Elueer de peptiden door het draaien bij 14.000 xg gedurende 15 min. Spoel de resterende peptiden van de filter met 400 ul 1% mierenzuur en 0,001% Zwittergent 3-16 (quench buffer). Elueer van de filter door het draaien bij 14.000 xg gedurende 15 min. Kwantificeren van de peptide-concentratie in de monsters door Bradford 19 of BCA assay 20. Incubate peptide monsters in de -80 ° C vriezer tot bevroren (30-60 min). Droge voltooid, bij kamertemperatuur, onder vacuüm concentrator (4-6 uur). OPMERKING: Droge peptiden kunnen tot drie maanden worden bewaard bij -20 ° C. Resuspendeer tryptische eiwitten net voorafgaand aan Liquid chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) analyse 2% acetonitril, 98% H2O en 0,1% mierenzuur (mobiele fase A) tot de gewenste concentratie. Tryptische peptide concentraties van 2,5 pl plasma range 100-300 ng / ul. 5. Derivatisering van N-gebonden glycanen met Hydrofobe hydrazide Tags Reconstitueren gedroogd zware (SIL) of licht (NAT) P2GPN reagentia in 1 ml 75:25 MeOH: azijnzuur (Derivatisering oplossing), om een ​​eindconcentratie van 0,25 mg / ml. Reagentia zal duren tot 10 minuten volledig oplosbaar. Uitvoerig vortex om volledige solubilisatie waarborgen. Opmerking: Bij deze derivatisering protocol wordt gebruikt met standaard N-glycanen, versus gezuiverd glycanen, de molaire verhouding van P2GPN: glycaan duurt ongeveer (en niet minder) dan 17 zijn: 1. Tag gedroogd N-glycanen met 200 pi (50 ug) van SIL of NAT P2GPN reagens. Pipet op en neer om gedroogde glycanen mengen. vortex samples en dan spin down monsters voor ~ 5 sec op een bench-top centrifuge. Reageren de glycanen met het reagens gedurende 3 uur bij 56 ° C. Onmiddellijk naar glycanen uit de incubator het vacuüm concentrator. Droge voltooid bij 55 ° C (3-5 uur). OPMERKING: Deze stap lest de derivatisering reactie; het monster moet volledig droog kruisreactiviteit in de volgende stappen te voorkomen. OPMERKING: Droge, hebben monsters tot zes maanden worden bewaard bij -20 ° C. Resuspendeer hebben N-glycanen in 25-50 pl H2O vlak voor LC-MS analyse. Pipet op en neer om ervoor te zorgen N-glycanen zijn volledig oplosbaar gemaakt. Opmerking: Het volume voor resuspensie is afhankelijk van de uitgangsconcentratie van glycoproteïne die geschat kunnen worden uit de start eiwitconcentratie. Toch zal het bereik varieert per monster type en moet individueel worden geoptimaliseerd. Centrifugeer monsters bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant, en let niet te laten de punt van de pipet raakt de bodem van de centrifugebuis. Opmerking: Overmatige tag mogelijk niet zichtbaar voor het oog, maar wordt verminderd door centrifugeren. Combineer een paar NAT en SIL monsters desgewenst relatieve kwantificering, in een 1: 1 verhouding voor tandem analyse. 6. Ultra-hoge druk vloeistofchromatografie en massaspectrometrie Analyse LET OP: De LC en MS beschreven voor een Easy nLC-1000 en een Q Exactive High Field voorwaarden, respectievelijk, werden geoptimaliseerd in-house voor proteomics analyse en voor de glycan analyse 21. Deze voorwaarden kunnen worden aangepast aan andere ultra-hoge druk- of nano- LC systemen en andere elektrische massaspectrometers high-oplossing maar kunnen kleine wijzigingen vereisen. Het gebruik van te hoge resolutie massaspectrometrie is noodzakelijk glycan identificatie en deamidering analyse 22,23. OPMERKING: Stappen 6,1-6,3 kan zijn skipped wanneer de juiste omgekeerde fase chromatografie of hydrofiele interactie commerciële val en kolom worden gebruikt. Synthetiseren een frit 100 uM ID capillair volgens Meiring et al. 24 voor toepassing als een val. Verpak de val onder druk met 2,6 uM, 100 A, C 18 verpakkingsmateriaal en gesneden tot een lengte van 5 cm. Pack een 75 uM ID emitter kolom onder druk met 2,6 uM, 100 A, C 18 verpakkingsmateriaal en gesneden tot een lengte van 30 cm. Bereid twee verschillende LC-MS methoden voor de proteomics (6.4.1) en glycomics (6.4.2) workflows. Opmerking: Eiwit en glycan monsters kunnen worden uitgevoerd op de zelfde opstelling val / column in willekeurige volgorde. Voor eiwitanalyse Injecteer ~ 400 ng eiwit op de kolom in mobiele fase A (MPA). Laat het monster bij 300 nl / min, volgens tabel 1, met 1 pi pre-kolomequilibratiebuffer (500 bar) en een 5 pl analytische kolomequilibratiebuffer(500 bar). Ioniseren eiwitten onder het MS omstandigheden in tabel 2. Voor glycan analyse Injecteer 5 ul geresuspendeerd, P2GPN hebben NAT / SIL equimolaire monsters op de kolom. Laat het monster bij 300 nl / min, volgens tabel 3, met 2 pi pre-kolomequilibratiebuffer (500 bar) en een 5 pl analytische kolomequilibratiebuffer (500 bar). Ioniseren glycanen onder de MS omstandigheden in tabel 4. Tijd % MPA % MPB 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 Tabel 1. LC voorwaarden voor proteoomanalyse. Een gradiëntelutie met mobiele fase B (MPB, 98% acetonitril, 2% H2O, 0,1% mierenzuur) werd uitgevoerd om peptiden jachtgeweer proteomics, data-afhankelijke acquisitie elueren MS experimenten. MS 1 Parameters Mass Range (Th) 375-1500 Resolutie 120.000 AGC 1 x 10 6 Max ionisatie Time 30 S-Lens FR Level 55 capillaire Temp (° C) 300 Spray Voltage 1.75 MS 2 Parameters acquisitie Type top20 Resolutie 15.000 AGC 1 x 10 5 Max ionisatie Time 30 ondervulling Ratio 2% Isolatie Window (Th) 1.4 Laadtoestand Uitsluiting 1 Genormaliseerde Collision Energy 27 Uitsluiting Time (s) 20 Tabel 2: MS voorwaarden voor proteomics analyse van de parameters voor electrospray ionisatie, MS 1 acquisitie, en MS 2 acquisitie in een orbitrap instrument met hogere energie dissociatio.n (HCD) gegeven. Tijd % MPA % MPB 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 Tabel 3:. LC condities voor glycaan analyse Gradient elutie werd uitgevoerd elueerde hydrazide hebben N-glycanen voor MS analyse. <tr> MS 1 Parameters Mass Range (Th) 600-1900 Resolutie 60.000 AGC 5 x 10 5 Max ionisatie Time 64 S-Lens FR Level 65 Capillaire Temp (° C) 325 Spray Voltage 1.75 MS 2 Parameters acquisitie Type top12 Resolutie 15.000 AGC 5 x 10 4 Max ionisatie Time 100 ondervulling Ratio 1% Isolatie Window (Th) 1.4 Vaste Eerste Mass </td> 125 Stapte Genormaliseerde Collision Energy 10/20/30 Uitsluiting Time (sec) 15 Tabel 4: MS voorwaarden voor hydrazide tag N-glycan analyse van de parameters voor electrospray ionisatie, MS 1 acquisitie, en MS 2 acquisitie in een orbitrap instrument met een hogere energie-dissociatie (HCD) worden gegeven.. 7. Proteomics en Deamidatie Analyse Identificeer eiwitten / peptiden met behulp van standaard bioinformatica zoekfuncties. Opmerking: De volgende analyse protocol werd ontworpen met behulp van de Swiss-Prot / Trembl databases in UniprotKB en zoeken via SEQUEST in de Proteome Discoverer 1.4 software, maar het protocol kan direct worden vertaald naar een eiwit search engine en scoren met behulp van een GUI-software. Alle opdrachten hieronder weergegeven kunnen worden geraadpleegd in de software-interfaces door middel van drop-down menu's. <li> maken of downloaden van een organisme geschikte eiwitsequentie database genomische data of ter beschikking proteoom databases zoals beschreven door Apweiler et al. 25 Opmerking: Common proteoom databases bevatten Swiss-Prot, Trembl, en NCBI, maar kan worden gebouwd van in-house gegevens, alsmede. Binnen de software, kies een database zoekmachine en selecteer parameters op basis van de kwaliteit van de verkregen gegevens en de strengheid van de gewenste zoeken, zoals beschreven door Perkins et al. voor MASCOT 26 of Eng et al. voor Sequest 27. Voor high-mass nauwkeurigheid van de gegevens, set parameters voor het zoeken in de software als volgt: max 2 gemiste breuklijnen, 5 ppm voorloper massa tolerantie, en 0,02 Da fragment massa tolerantie (voor optimale accurate deamidering detectie 22) en omvatten de volgende tryptische peptide modificaties "carbamidomethyl (C)" statische modificatie en "deamidering (N / Q)" en "oxidation (M) "dynamische veranderingen. Bij gebruik 18 O digestie labeling bevatten" deamidering 18 O (1) "als extra dynamische wijziging. Zoek met behulp van de gekozen motor, de ruwe peptide data tegen het eiwit database (7.1.1). Opmerking: Mass toleranties moet geschikt zijn voor het gebruikte instrument en niet willekeurig laag zijn. Opmerking: De zoekfunctie wordt automatisch ingevuld door de software met behulp van verschillende zoekmachines specifieke algoritmes. De percolator algoritme (MASCOT), SEQUEST of andere combinaties van algoritmen worden toegepast om eiwitten te identificeren van peptiden en de geldigheid van de treffers behaalt; meer informatie over de beschikbare instrumenten worden behandeld in een recensie van Gonzalez-Galarza et al. 28,29. Afhankelijk van de software, kunnen extra zoekparameters moeten worden afhankelijk van de beoordeling van de gebruiker. Exporteer de geïdentificeerde peptiden voor handmatige curation en Fürther analyse. Handmatig curate een lijst van peptiden die een geïdentificeerde deamidering op asparagine van de N-gebonden glycosylering motief (NX (S / T), waarin X ≠ P). Cross-valideren deze sites met bekende glycosylering motieven uit de literatuur en het creëren van twee zwembaden van de resultaten (gevalideerd en theoretisch). Gebruik spectrale tellen 30 om het percentage bezetting van een gegeven glycosyleringsplaats vergelijken door vergelijking van de overvloed aan gedeamideerde en niet gedeamideerde vormen. 8. Glycan Relatieve kwantificering Opmerking: De volgende identificatie en kwantificatie werd voltooid met behulp van de Xcalibur software. Echter, alle software die ruwe data analyseert en automatisch integreert chromatografische pieken kunnen worden vervangen. Genereer een theoretische overzicht van glycan composities uit de biologisch mogelijke combinaties van hexosen, deoxy-hexosen, hexosamines, siaalzuren en andere saccharides. Daartoe is een menselijke glycan databank gepubliceerd door Walker et al. 15 en kunnen worden gebruikt zoals het is. Voor theoretische databases, moet soortspecifieke biologische beperkingen worden opgelegd aan de combinatorische ruimte, en deze regels worden beschreven door Kronewitter et al. 31. Bereken de glycan mono-isotopische massa (M) van de atomaire massa's voor elke compositie voor proton lading staten + 1-3. Wijzig de mono-isotopische massa van de toevoeging van de NAT (254,14191 g / mol) of SIL (260,162042 g / mol) P2GPN tag bevatten. Open de "Processing Setup" programma van de routekaart uitzicht in Xcalibur. Stel een verwerkingsmethode precies in het Aanvullend materiaal beschreven door Walker et al. 15 met de lijst gegenereerd in stap 8.2 met de theoretische mono-isotopische massa van de [M + H] 1+, [M + 2H] 2+ en [ M + 3H] 3+ soorten. Opmerking: Om glycaan identiteit daarbuiten nauwkeurig te bevestigenmassa, voor NAT / SIL dubbelzijdig runs, controleer dan of NAT en SIL N-glycan paren co-elueren met dezelfde retentietijd. Kwalitatief cross-identificaties bevestig met de MS spectra 2, waarbij pieken behorend tot de oxonium ion serie 32 moet bevatten. Exporteer de geïntegreerde, geëxtraheerd ion chromatogram (XIC) gebieden om Excel aan de SIL en NAT abundanties precies in het Aanvullend materiaal beschreven van Walker et al te verkrijgen. 15 In Excel programma de cellen in een nieuwe kolom aan de correctie van het molecuulgewicht overlap berekenen door aanpassing van de SIL overvloed volgens een door Walker e.a. vergelijking 1 5.: , waarbij A de mono-isotopische piek en de theoretische isotoop overlap, , Kunnen onafhankelijk van elkaar worden berekend per samenstelling. In een tweede kolom, het programma cellen NAT en SIL kanalen normaliseren behulp van de vergelijking van het totale genormaliseerde glycan factor (TGNF), per spectrum, zoals beschreven door Walker et al 1 5.: , waarbij N het aantal N-glycanen boven de limiet van kwantificering. In een nieuwe kolom Programmeer de cellen met de verhouding tussen SIL nemen: NAT glycanen (of vice versa) om de veelvoudverandering concentratieverhouding tussen de twee monsters te berekenen.

Representative Results

Figuur 1:. De regeling van de HOEKTANDEN-P2GPN hydrofobe tagging gekoppeld methode (methode A) voor gecombineerde proteomics en glycomics analyse wordt gegeven Stappen die verschillen tussen glycomics-enige vorm van verwerking en tandem glycomics en proteomics analyse, met glycosylatieplaats identificatie, worden gemarkeerd. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. De in-line proteoomanalyse en glycomics, filter-gebaseerde P2GPN hydrofobe tagging methode (methode A) werd gevalideerd voor de identificatie, kwantificering en molecuulgewicht voorspanning waarbij gebundelde hen plasmamonsters (Figuur 1). Voor uitsluitend glycomics experimenten, glycanen onderlinge vergelijkingen in de abundanties van N gewonnen door MethodA Carbograph SPE (gouden standaard, methode B) werden gemaakt (figuur 2). Er waren geen significante verschillen in de dichtheden van glycanen tussen beide methoden. De intra-variabiliteit werd ook beoordeeld door het kwantificeren van de SIL: NAT verhouding glycanen geëxtraheerd volgens dezelfde werkwijze. De log 2 -distributions van beide methoden waren Gaussian, gecentreerd op nul en niet significant verschillend (Figuur 3A-B). Het molecuulgewicht varieert tussen de twee protocollen volledig overlappende, wat suggereert dat het filter niet discrimineren N-glycanen basis van moleculaire gewichtsbereik en hydrofiliciteit (figuur 4). Figuur 2: Een equimolair mengsel van NAT en SIL N-glycanen geëxtraheerd volgens werkwijze A of werkwijze B werd bereid uit 2,5 pl hen plasma (N = 4) De monsters waren anal.yzed door UPLC-MS volgens de aanbevolen parameters in paragraaf 6. De abundances per glycan voorgesteld, in elke NAT / SIL kanaal, berekend door integratie van de oppervlakte onder de geëxtraheerde ionenchromatogram (MMA = 3 ppm) en corrigeert de moleculaire gewicht overlap, en aanpassen door de TGNF. Deze ratio's worden getoond met hun standaard fouten. De dichtheden van Methode B: Methode A N-glycanen waren niet significant verschillend (p> 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: De intra-variabiliteit in de (A) Methode A (N = 133) of (B) Methode B (N = 123) strategieën vergeleken. NAT en SIL equimolaire mengsels van N-glycanen, uit dezelfde extractie schemaWerden geanalyseerd via drie technische replicaten. De log 2 -distributions werden gecentreerd op nul en waren niet significant verschillend tussen de twee workflows. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Het molecuulgewicht varieert van glycanen van elke strategie vergeleken. De twee workflows leverde glycanen verspreid over hetzelfde gewicht bereik moleculaire. N-glycanen aangetroffen in een protocol ten opzichte van de andere viel net boven de detectielimiet (1 x 10 5 overvloed) en komen niet overeen met systematische vooringenomenheid. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur. <p class="jove_content" fo:keep-together.binnen-page = "1"> Behoud van het gedeglycosyleerde eiwitten door het molecuulgewicht filter ingeschakeld in-line proteoom brede analyse en glycosyleringsplaats identificatie. Meerdere protocollen voor gecombineerde zuivering van glycanen en eiwitten werden vergeleken met een traditionele FASP preparaat zonder deglycosylering (Tabel 5). Onze typische 18 uur filter gebaseerd PNGase F vertering, gevolgd door FASP trypsine digestie (Std protocol) geleid tot aanzienlijke niveaus van niet-specifieke deamidering, die kunnen interfereren met de identificatie van glycosites. Daarom is een methode waarbij een kortere incubatietijd bij verhoogde temperatuur (50 ° C) en een PNGase F piek in stap (SPI protocol) werd onderzocht als alternatief, samen met een microgolfontsluiting protocol (MD protocol), die niet-minimaliseren specifieke deamidering. De glycanen waargenomen in de nieuwe digestiemethoden waren niet significant verschillend in samenstelling of abundanties van de standaard 18 uur, 37 ° C filter PNGase F digest ( <strong> Figuur 5). Gecombineerd met een korte trypsine incubatie werd aspecifieke deamidering aanzienlijk verminderd, met een vals positieven voor glycosites <5% (Tabel 5). eiwitten peptiden gedeamideerde Peptiden Glycosites glycoproteïnen + – + – + – + – + – FASP <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18 MD 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8 . Tabel 5: Vergelijkingen van proteomics data van een standaard trypsine verteren ten opzichte van de in-line HOEKTANDEN-P2GPN tagging methode werden voorbereidingen getroffen werden uitgevoerd met (+) en zonder (-) PNGase F op de achtergrond de tarieven van de niet-specifieke deamidering en de raming te bepalen glycosite vals positieve tarieven. Eiwitten werden geïdentificeerd met 1% valse ontdekking tarief (FDR); peptiden werden gefilterd op basis van peptide vertrouwen "hoog" in Proteome Discoverer 1,4 (q <0,01); glycosites werden identified basis van unieke sequenties die deamidering van het geconserveerde motief glycosylering (NXS / T); en glycoproteïnen werden gedefinieerd als geïdentificeerde eiwitten die ten minste één geïdentificeerde glycosite. Figuur 5: Verkorte protocollen voor glycanen werden ontwikkeld om deaminering in de monsters te minimaliseren en vergeleken met de 18 uur HOEKTANDEN PNGase F vertering. De gemiddelde verschillen waren in dichtheden 10% en 5% van de MD (2.2.3) en SPI (2.2.2) protocollen, respectievelijk. Van de 48 glycanen geïdentificeerd, 90% weergegeven minder dan 1,5-voudige variatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with ¹⁸O labeling of Asn during the PNGase digestion step^22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Materials

Acetic Acid (50%):	Sigma Aldrich	45754
Acetonitrile, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH015-4
Ammonium Bicarbonate	Sigma Aldrich	A6141
Bradford Reagent	Sigma Aldrich	B6916	Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016
Centrifuge	Eppendorf	5804 R	Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution	Sigma Aldrich	646563
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack	TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens	Fisher Scientific	11-690-625F	Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid	Sigma Aldrich	56302
GE Microwave Oven	General Electric	57B5 E82904	Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase	Phenomenex	Bulk Media	Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM
Mascot Daemon Software and Server	Matrix Science		Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm	New Objective	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific		Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B	New England Biolabs	P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas	Sigma Aldrich	T6567-5X
Urea	Sigma Aldrich	51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	SPD131DDA	Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH365-4
Water, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit	Merck Millipore	693030