एक मात्रात्मक Glycomics और प्रोटिओमिक्स संयुक्त शोधन रणनीति

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate ¹⁸O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

प्रोटिओमिक्स के क्षेत्र में, फिल्टर सहायता प्राप्त नमूना तैयार (FASP) व्यापक रूप से शुरू सामग्री की मात्रा को कम नमूना तैयार कलाकृतियों में कमी, और नमूना throughput ¹ को अधिकतम करने की क्षमता के लिए अपनाया गया है। हालांकि, इस तरह के एक विधि अभी तक उभरने और Glycomics के क्षेत्र के लिए कर्षण हासिल करने के लिए किया गया है। उच्च throughput का विकास, मात्रात्मक वर्कफ़्लोज़ जैविक रक्षा में ग्लाइकोसिलेशन का अभिन्न भूमिका और कैंसर या बीमारियों ^2,3 द्वारा अपने मॉडुलन की वजह से जरूरत है। स्तनधारियों में, एन -glycans सैकराइड इकाइयों (hexoses (हेक्स), hexosamines (HexNac), सियालिक एसिड (NeuAc), और fucoses (fuc)) है, जो एक मूल संरचना को सजाने (हेक्स ₃ HexNac ₂₎ ⁴ covalently बाध्य दोहरा से बना रहे हैं asparagine करने के लिए। हालांकि glycospace काफी बड़ी है जब isomers गिने जाते हैं (> 10 से ^12), यह काफी छोटा एक संरचना के आधार पर है और आणविक भार आम तौर पर 1,000-8,000 दा ^{5 <से} लेकर/ Sup>। वर्ग की compositional एकरूपता और ग्लाइकान के hydrophilicity शोधन, जुदाई के लिए अद्वितीय चुनौतियां खड़ी हैं, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) ⁶ workflows।

परंपरागत रूप से, एन -glycans -glycosidase peptide- एन से प्रोटीन या पेप्टाइड्स से पच जाता है एफ (PNGase एफ) और फिर hydrazide मोती ⁸ से, लेक्टिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी ⁷ से समृद्ध पर कब्जा कर लिया, या ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) ^9,10 के माध्यम से शुद्ध। इन तरीकों सभी अत्यधिक प्रभावी रहे हैं, वे desalting के लिए अतिरिक्त कदम परिचय और सीमा नमूनों की संख्या एक साथ कार्रवाई की। पिछले दशक के दौरान, Glycomics के लिए उच्च throughput प्लेटफार्मों के एक नंबर का प्रस्ताव किया गया है। किम एट अल। प्रकाशित एक अर्द्ध स्वचालित विधि एक वैक्यूम संचालित, एसपीई 96 अच्छी तरह से थाली ¹¹ का उपयोग। वैकल्पिक रूप से, एक समानता फिल्टर विधि (एन -glyco-FASP) मान समूह है, जो फाई की प्रारंभिक derivatization आवश्यक द्वारा विकसित किया गया थाlectins ¹² के एक समग्र के साथ lter। अन्त में, थॉमस-ओट्स समूह एक अर्द्ध मात्रात्मक विधि, फ़िल्टर एडेड एन -Glycan पृथक्करण (नुकीले), जो glycospace ¹³ की संकीर्ण संरचना आकार शोषण का प्रस्ताव रखा। आणविक वजन कट ऑफ फिल्टर पर निर्भर है, छोटी दूषित पदार्थों को बर्बाद करने के लिए पहली बार धोया गया और उसके बाद एन -glycans पचता है और eluted थे। Deglycosylated प्रोटीन इस प्रोटोकॉल में फिल्टर पर बने हुए हैं और लाइन में FASP के अधीन किया जा सकता है।

पहचान और electrospray आयनीकरण द्वारा ग्लाइकान की मात्रा का ठहराव (ईएसआई) एमएस (आंशिक) isomers और derivatization का संकल्प कम प्रचुर प्रजातियों का पता लगाने के लिए के लिए बंद लाइन विभाजन की आवश्यकता है। व्यक्तित्व में लेबलिंग जब glycan hydrazide टैग को सामान्य बनाने की रणनीति के साथ रिवर्स चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (RPLC) ^14,15 के साथ अनुकूलता प्रदान करता है। 4-phenethyl-benzohydrazide (P2PGN) हाइड्रोफोबिक टैग ग्लाइकान के hydrophilicity मध्यस्थता, ENHद्वारा आयनीकरण ancing औसत पर, चार गुना ^16। 1 सतही परिस्थितियों में stoichiometrically: हालांकि इस तरह के permethylation ¹⁷ या एमाइन प्रतिक्रियाशील टैगिंग chemistries ^18, के रूप में अन्य तकनीकों, इसी तरह के लाभ प्रदान करते हैं, hydrazide प्रतिक्रिया में, ग्लाइकान 1 प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं। सापेक्ष मात्रा का ठहराव देशी (नेट) या ¹³ सी ₆ स्थिर आइसोटोप लेबल (एसआईएल) के साथ मिलकर derivatized नमूने के विश्लेषण के द्वारा हासिल की है।

निम्न विधि प्लाज्मा अनुप्रयोगों और यह युगल सटीक रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए P2GPN हाइड्रोफोबिक टैग करने के लिए नुकीले विकसित। इसके अलावा, यह विश्लेषण की अखंडता समझौता किए बिना, नमूना का एक भी विभाज्य पर गोली-बंदूक प्रोटिओमिक्स, deamidation रूपरेखा, और मात्रात्मक Glycomics प्रदर्शन करने के लिए डिजाइन किया गया था।

Protocol

1. प्रोटीन और ग्लाइकोप्रोटीन विकृतीकरण और alkylation मानक की तैयारी, लोड एक 30 केडीए पर ग्लाइकोप्रोटीन (जैसे Fetuin या RNase बी) के एक 0.1 माइक्रोग्राम / μl समाधान के 2.5 μl या 10 केडीए आणविक वजन (मेगावाट) कट ऑफ फिल्टर के लिए। जैविक चाय के नमूने लिए, एक मानक ब्रैडफोर्ड 19 या 20 bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता की जाँच करें। 10-100 मिलीग्राम / एमएल कुल प्रोटीन के बीच रोकने के लिए ~ 7 का पीएच पर, प्लाज्मा पतला, यदि आवश्यक हो तो एच में 100 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (एनएच 4 HCO 3) 2 ओ (PNGase डाइजेस्ट बफर) के साथ। लोड 2.5 μl प्लाज्मा (25-250 ग्राम प्रोटीन) एक फिल्टर पर। नोट: इस प्रोटोकॉल केवल ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) की उपस्थिति में एकत्र रक्त के नमूनों से प्लाज्मा पर परीक्षण किया गया है। फिल्टर में प्रत्येक नमूने के लिए 1 एम dithiothreitol समाधान (डीटीटी) के 2 μl जोड़ें। 20 के साथ नमूना पतला0 μl PNGase बफर पचाने। फिल्टर नमूना ट्यूब और हल्के से भंवर कैप, अपनी सीट से फिल्टर परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है। 56 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते 30 मिनट प्रोटीन और ग्लाइकोप्रोटीन denature करने के लिए। नमूने alkylate करने के लिए, 50 μl 1 एम iodoacetamide जोड़ने ~ 200 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए, और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। नोट: प्रोटिओमिक्स विश्लेषण वांछित नहीं है, तो 1.5 कदम को छोड़ दिया जा सकता है। 40 मिनट के लिए 14,000 XG पर नमूने centrifuging द्वारा फिल्टर पर विकृत ग्लाइकोप्रोटीन ध्यान लगाओ। के माध्यम से प्रवाह त्यागें। 2. एन से जुड़े glycan enzymatic पाचन 100 μl के साथ नमूना धो PNGase बफर पचाने। 20 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर पर ध्यान लगाओ और ग्लाइकोप्रोटीन के माध्यम से प्रवाह त्यागें। धोने और ध्यान कदम दो बार दोहराएँ, तीन बार की कुल के लिए, फिल्टर मृत मात्रा (~ 5 μl) में एक ध्यान से बेदखल। सभी त्यागेंके माध्यम से प्रवाह। washes एक बार त्यागें संग्रह शीशी पूरा कर रहे हैं। भविष्य की सभी eluents और एक नया संग्रह शीशी में washes लीजिए। नोट: PNGase एच 2 ओ में 18 बफर पचाने de-ग्लाइकोसिलेटेड asparagine साइटों, जो रासायनिक deamidated बनने के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के लिए PNGase एफ पाचन चरण के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है। एक ताजा संग्रह शीशी को स्थानांतरित करने के बाद फिल्टर करने के लिए ग्लिसरॉल मुक्त PNGase एफ (75,000 एक्स इकाइयों / एमएल) के 2 μl जोड़ें। PNGase के 98 μl बफर पचाने, 100 μl के लिए कुल मात्रा लाने, और धीरे मिश्रण करने के लिए फिल्टर पर ऊपर और नीचे पिपेट और जोड़ें। Enzymatically कदम 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 में या शर्तों के तहत ग्लाइकान पचाने। नोट: प्रोटीन का deglycosylation के लिए तीन तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है। पूरी तरह Glycomics विश्लेषण (कोई प्रोटिओमिक्स) के लिए, कदम 2.2.1 में लंबे ऊष्मायन की सिफारिश की है। Glycomics और प्रोटिओमिक्स अनुसंधान के लिए, कदम 2.2.2 और 2.2.3 कम से कम गैर-सपा के साथ उच्च गुणवत्ता पेप्टाइड्स का उत्पादन होगाecific deamidation। Glycomics केवल पाचन प्रोटोकॉल (18hr): enzymatically सभी एन -glycans फोड़ना करने के लिए 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। कील में पाचन प्रोटोकॉल (एसपीआई): 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। जल्दी से काम करते हुए, ग्लिसरॉल मुक्त PNGase एफ (75,000 एक्स इकाइयों / एमएल) की एक अतिरिक्त 2 μl में नमूने और कील को हटा दें। हल्के से 1-2 सेकंड मिश्रण करने के लिए नमूने भंवर। एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। माइक्रोवेव पाचन प्रोटोकॉल (एमडी): एक microcentrifuge ट्यूब चल रैक में रखें नमूने हैं। एक 1 एल बीकर में नाव नमूने विआयनीकृत (डीआई) पानी का 1 एल के साथ भर दिया। एक माइक्रोवेव ओवन (950 डब्ल्यू) एक घूर्णन थाली के साथ के केंद्र में बीकर रखें। 5 मिनट के लिए 60% बिजली (570 डब्ल्यू) में माइक्रोवेव। शांत करने के लिए, नमूने को हटा दें और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पकड़। फिर 60% बिजली पर एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए माइक्रोवेव। नोट: माइक्रोवेव पावर सेटिंग्स माइक्रोवेव की अधिकतम बिजली उत्पादन के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता होगी।औसत बिजली मॉडलों के बीच लगातार आयोजित किया जाना चाहिए। 3. एन के क्षालन -glycans 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 XG पर नमूना centrifuging द्वारा ग्लाइकान Elute। PNGase के 100 μl 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज के लिए बफर पचाने जोड़ें। लीजिए धोने किसी भी शेष एन युक्त glycan से जुड़े, eluent के रूप में ही संग्रह शीशी में। दो बार दोहराएँ। नया संग्रह शीशी में फिल्टर और जगह निकालें। जमे हुए (30-60 मिनट) तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में glycan नमूने सेते हैं। पूरा होने, कमरे के तापमान पर, शून्य concentrator (4-6 घंटा) में करने के लिए सूखी। नोट: एन -glycans अप करने के लिए छह महीने से पहले derivatization के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। 4. प्रोटीन FASP पाचन नोट: प्रोटिओमिक्स या deamidation साइट विश्लेषण वांछित नहीं है, तो प्रोटोकॉल की धारा 4 को छोड़ दिया जा सकता है। टी कुल्लावह फिल्टर, deamidated पेप्टाइड्स युक्त, 8 एम यूरिया बफर के 400 μl के साथ। कैप संग्रह शीशी और हल्के से मिश्रण करने के भंवर। 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर पर ध्यान लगाओ। सभी प्रवाह के माध्यम से त्यागें। दोहराएँ कदम 4.1 दो अतिरिक्त समय, तीन यूरिया बफर washes के एक कुल के लिए। 2 एम यूरिया, 10 मिमी 2 CaCl बफर के 400 μl (trypsin पचाने बफर) के साथ फिल्टर कुल्ला, deamidated पेप्टाइड्स युक्त। कैप संग्रह शीशी और हल्के से मिश्रण करने के भंवर। 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर पर ध्यान लगाओ। सभी प्रवाह के माध्यम से त्यागें। दोहराएँ कदम 4.1 दो अतिरिक्त समय, तीन trypsin की कुल के लिए बफर washes पचाने। washes एक बार त्यागें संग्रह शीशी पूरा कर रहे हैं। भविष्य की सभी eluents और एक नया संग्रह शीशी में washes लीजिए। (/ डब्ल्यू डब्ल्यू) खोज या मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स प्रयोगों के लिए अनुपात क्रमश: प्रोटीन: 5 trypsin: में एक 1:50 या 1 50 μl सुअर का संशोधित trypsin जोड़ें।कैप संग्रह शीशी और हल्के से मिश्रण करने के भंवर। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। 5 trypsin: प्रोटीन अनुपात जल्दी से कार्य करना, 1:50 या 1 पर trypsin के एक अतिरिक्त 50 μl में नमूने और कील को हटा दें। हल्के से 1-2 सेकंड मिश्रण करने के लिए नमूने भंवर। एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर कताई द्वारा पेप्टाइड्स Elute। 400 μl 1% फार्मिक एसिड और 0.001% Zwittergent 3-16 (बुझाना बफर) के साथ फिल्टर से शेष पेप्टाइड्स कुल्ला। 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर कताई द्वारा फिल्टर बंद Elute। ब्रैडफोर्ड 19 या बीसीए परख 20 नमूनों में पेप्टाइड एकाग्रता यों। -80 में पेप्टाइड नमूने सेते सेल्सियस फ्रीजर तक जमे हुए (30-60 मिनट)। पूरा होने, कमरे के तापमान पर, शून्य concentrator (4-6 घंटा) में करने के लिए सूखी। नोट: सूखे पेप्टाइड्स अप करने के लिए तीन महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। Resuspend tryptic प्रोटीन सिर्फ liqui करने से पहलेडी क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस) 2% acetonitrile में विश्लेषण, 98% एच 2 हे, और 0.1% फार्मिक एसिड (मोबाइल चरण ए) वांछित एकाग्रता के लिए। 2.5 μl प्लाज्मा रेंज से tryptic पेप्टाइड सांद्रता 100-300 एनजी / μl। 5. एन के derivatization से जुड़े के साथ जल विरोधी hydrazide टैग ग्लाइकान , एसिटिक एसिड (derivatization समाधान) 0.25 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए: 75:25 MeOH के 1 मिलीलीटर में सूखे भारी (एसआईएल) या प्रकाश (नेट) P2GPN अभिकर्मकों Reconstitute। अभिकर्मकों 10 मिनट तक का समय लग पूरी तरह से solubilize के लिए होगा। बड़े पैमाने पर भंवर पूरा solubilization सुनिश्चित करने के लिए। नोट: इस घटना में derivatization प्रोटोकॉल मानक एन -glycans, बनाम शुद्ध ग्लाइकान, P2GPN की दाढ़ अनुपात के साथ प्रयोग किया जाता है: glycan लगभग (और भी कम नहीं) की तुलना में 17 होना चाहिए: 1। टैग सूखे एन एसआईएल या नेट P2GPN अभिकर्मक के 200 μl (50 ग्राम) के साथ -glycans। सूखे ग्लाइकान resuspend करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और। भंवर SAmples और फिर एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र पर ~ 5 सेकंड के लिए नमूने नीचे स्पिन। 56 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए अभिकर्मक के साथ ग्लाइकान प्रतिक्रिया। इसके तत्काल बाद शून्य concentrator को इनक्यूबेटर से ग्लाइकान चलते हैं। 55 डिग्री सेल्सियस (3-5 घंटा) पर पूरा करने के लिए सूखी। नोट: यह कदम derivatization प्रतिक्रिया quenches; नमूना पूरी तरह से बाद के चरणों में पार जेट को रोकने के लिए शुष्क होना चाहिए। नोट: सूखे, टैग नमूने अप करने के लिए छह महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। Resuspend एच 2 ओ की 25-50 μl में टैग एन -glycans सिर्फ नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण करने से पहले। यह सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से एन -glycans solubilized हैं ऊपर और नीचे पिपेट और। नोट: मेजबान के लिए मात्रा ग्लाइकोप्रोटीन के शुरुआती एकाग्रता, जो शुरुआती प्रोटीन एकाग्रता से अनुमान लगाया जा सकता है पर निर्भर है। हालांकि, सीमा नमूना प्रकार प्रति अलग अलग होंगे और व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया जाना चाहिए। 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं। supern हटायेatant, सावधान किया जा रहा पिपेट की नोक अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे छू जाने के लिए नहीं। नोट: अतिरिक्त टैग आंखों को दिखाई नहीं हो सकता है, लेकिन centrifugation से कम हो जाएगा। नेट और एसआईएल के नमूने की एक जोड़ी का मिश्रण है, अगर, रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए वांछित एक 1: 1 के अनुपात में मिलकर विश्लेषण के लिए। 6. अल्ट्रा उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण नोट: नियंत्रण रेखा और एमएस की स्थिति एक आसान एनएलसी-1000 और एक क्यू Exactive हाई फील्ड के लिए वर्णित है, क्रमशः, घर में प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए और glycan विश्लेषण 21 के लिए अनुकूलित किया गया। इन शर्तों अन्य अति उच्च दबाव या नैनो नियंत्रण रेखा प्रणाली और अन्य उच्च शक्ति को हल मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन मामूली संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। उच्च शक्ति को हल मास स्पेक्ट्रोमेट्री के उपयोग glycan पहचान और विश्लेषण deamidation 22,23 के लिए आवश्यक है। नोट: 6.1-6.3 कदम हो सकता है रोंkipped अगर एक उचित रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी या हाइड्रोफिलिक बातचीत वाणिज्यिक जाल और स्तंभ इस्तेमाल कर रहे हैं। Meiring एट अल। एक जाल के रूप में उपयोग के लिए 24 के अनुसार 100 सुक्ष्ममापी आईडी केशिका में मिलाना synthesize। 2.6 माइक्रोन के साथ दबाव में जाल पैक, 100 ए, सी 18 पैकिंग सामग्री और 5 सेमी की लंबाई में कटौती। 2.6 माइक्रोन के, 100 ए, सी 18 पैकिंग सामग्री के साथ दबाव में एक 75 माइक्रोन के आईडी emitter स्तंभ पैक और 30 सेमी की लंबाई में कटौती। प्रोटिओमिक्स (6.4.1) और Glycomics (6.4.2) workflows के लिए दो अलग-नियंत्रण रेखा एमएस तरीकों से तैयार करें। नोट: प्रोटीन और glycan नमूने किसी भी क्रम में एक ही जाल / स्तंभ स्थापना पर चलाया जा सकता है। प्रोटीन विश्लेषण के लिए, एक मोबाइल चरण (एमपीए) में स्तंभ पर इंजेक्षन प्रोटीन की ~ 400 एनजी। 300 nl / मिनट पर नमूना चलाएँ, 1 टेबल के अनुसार, एक 1 μl पूर्व स्तंभ संतुलन (500 बार) और एक 5 μl विश्लेषणात्मक स्तंभ संतुलन के साथ(500 बार)। तालिका 2 में प्रदान एमएस की शर्तों के तहत प्रोटीन योण बनाना। glycan विश्लेषण के लिए, resuspended के 5 μl इंजेक्षन, P2GPN स्तंभ पर टैग की नेट / एसआईएल equimolar नमूने हैं। 300 nl / मिनट पर नमूना भागो, 3 टेबल के अनुसार, एक 2 μl पूर्व स्तंभ संतुलन (500 बार) और एक 5 μl विश्लेषणात्मक स्तंभ संतुलन (500 बार) के साथ। तालिका 4 में प्रदान एमएस की शर्तों के तहत ग्लाइकान योण बनाना। पहर % एमपीए % MPB 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 तालिका 1 प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए नियंत्रण रेखा की स्थिति। मोबाइल चरण बी (MPB, 98% acetonitrile, 2% एच 2 ओ, 0.1% फार्मिक एसिड) के साथ एक ढाल क्षालन शॉट गन प्रोटिओमिक्स, डेटा पर निर्भर-अधिग्रहण के लिए पेप्टाइड्स elute करने के लिए किया गया था , एमएस प्रयोगों। एमएस 1 पैरामीटर जन रेंज (ध) 375-1500 संकल्प 120,000 एजीसी 1 × 10 6 मैक्स आयनीकरण समय 30 एस लेंस एफआर स्तर 55 केशिका मंदिरपी (डिग्री सेल्सियस) 300 स्प्रे वोल्टेज 1.75 एमएस 2 मानकों अधिग्रहण के प्रकार Top20 संकल्प 15,000 एजीसी 1 × 10 5 मैक्स आयनीकरण समय 30 underfill अनुपात 2% अलगाव विंडो (ध) 1.4 आरोप राज्य बहिष्करण +1 सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा 27 बहिष्करण समय (s) 20 तालिका 2: एमएस उच्च-ऊर्जा dissociatio का उपयोग कर एक Orbitrap साधन में प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए शर्तों electrospray आयनीकरण के लिए मानकों, एमएस 1 अधिग्रहण, और एमएस 2 अधिग्रहण।n (HCD) दिया जाता है। पहर % एमपीए % MPB 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 तालिका 3:। Glycan विश्लेषण के लिए नियंत्रण रेखा की स्थिति एक ढाल क्षालन elute करने hydrazide टैग किए एन एमएस विश्लेषण के लिए -glycans प्रदर्शन किया गया था। <टीआर> एमएस 1 पैरामीटर जन रेंज (ध) 600-1900 संकल्प 60,000 एजीसी 5 × 10 5 मैक्स आयनीकरण समय 64 एस लेंस एफआर स्तर 65 केशिका अस्थायी (डिग्री सेल्सियस) 325 स्प्रे वोल्टेज 1.75 एमएस 2 मानकों अधिग्रहण के प्रकार Top12 संकल्प 15,000 एजीसी 5 × 10 4 मैक्स आयनीकरण समय 100 underfill अनुपात 1% अलगाव विंडो (ध) 1.4 फिक्स्ड पहले बड़े पैमाने पर </tडी> 125 कदम रखा सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा 10/20/30 बहिष्करण समय (सेकंड) 15 सारणी 4: hydrazide के लिए एमएस की स्थिति में टैग एन -glycan विश्लेषण electrospray आयनीकरण के लिए मानकों, एमएस 1 अधिग्रहण, और उच्च-ऊर्जा हदबंदी (HCD) का उपयोग कर एक Orbitrap साधन में एमएस 2 अधिग्रहण दिया जाता है।। 7. प्रोटिओमिक्स और Deamidation विश्लेषण मानक जैव सूचना विज्ञान खोज उपकरण का उपयोग कर प्रोटीन / पेप्टाइड को पहचानें। नोट: निम्न विश्लेषण प्रोटोकॉल UniprotKB में स्विस Prot / TrEMBL डेटाबेस का उपयोग और proteome करनेवाला 1.4 सॉफ्टवेयर में SEQUEST के माध्यम से खोज डिजाइन किया गया था, हालांकि, प्रोटोकॉल सीधे किसी भी प्रोटीन खोज और स्कोरिंग एक जीयूआई सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इंजन में अनुवाद किया जा सकता है। नीचे दिए गए सभी आदेशों ड्रॉप-डाउन मेनू के माध्यम से सॉफ्टवेयर इंटरफेस में पहुँचा जा सकता है। <li> बनाने के लिए या के रूप में Apweiler एट अल द्वारा वर्णित जीनोमिक डेटा या उपलब्ध proteome डेटाबेस से एक जीव उचित प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस डाउनलोड करें। 25 नोट: आम proteome डेटाबेस स्विस Prot, TrEMBL, और एन सी बी आई में शामिल हैं, लेकिन साथ ही घर में डेटा से बनाया जा सकता है। सॉफ्टवेयर के भीतर, के रूप में पर्किन्स एट अल द्वारा वर्णित है, डेटा की गुणवत्ता का अधिग्रहण किया है और खोज के वांछित rigorousness के अनुसार एक डेटाबेस खोज इंजन और चयन मानदंड चुनें। अल। SEQUEST 27 के लिए शुभंकर 26 या इंग्लैंड एट के लिए। उच्च जन सटीकता डेटा के लिए, सॉफ्टवेयर में खोज के लिए निर्धारित मापदंडों इस प्रकार है: मैक्स 2 चूक चोली, 5 पीपीएम अग्रदूत बड़े पैमाने पर सहिष्णुता, और 0.02 दा टुकड़ा बड़े पैमाने पर सहिष्णुता (अनुकूलित सटीक deamidation का पता लगाने के लिए 22) और निम्न tryptic पेप्टाइड संशोधनों में शामिल : "carbamidomethyl (सी)" स्थिर संशोधन और "deamidation (एन / क्यू)" और "बैलidation (एम) "गतिशील संशोधनों। अगर 18 हे पाचन लेबलिंग का उपयोग कर, शामिल हैं" deamidation 18 हे (1) "एक अतिरिक्त गतिशील संशोधन के रूप में। खोजें, चयनित इंजन, प्रोटीन डेटाबेस (7.1.1) के खिलाफ कच्चे पेप्टाइड डेटा का उपयोग कर। नोट: मास tolerances और इस्तेमाल साधन के लिए उचित मनमाने ढंग से कम नहीं होना चाहिए। नोट: खोज समारोह विभिन्न खोज इंजन विशिष्ट एल्गोरिदम का उपयोग सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से पूरा हो गया है। टपकाने का साधन एल्गोरिथ्म (शुभंकर), SEQUEST, या एल्गोरिदम के अन्य संयोजन पेप्टाइड्स से प्रोटीन की पहचान करने के लिए और हिट फिल्मों की वैधता स्कोर करने के लिए नियोजित कर रहे हैं; उपकरण उपलब्ध पर अधिक जानकारी। गोंजालेज Galarza एट अल 28,29 से एक समीक्षा में शामिल किया जाता है। सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, अतिरिक्त खोज मापदंडों उपयोगकर्ता के विवेक के अनुसार चयन किया जाना पड़ सकता है। मैनुअल curation और Furth के लिए पहचान की पेप्टाइड्स निर्यातएर विश्लेषण। मैन्युअल एन के asparagine पर एक पहचान deamidation युक्त पेप्टाइड्स की एक सूची उपपादरी ग्लाइकोसिलेशन मूल भाव से जुड़े (NX- (एस / टी) जहां एक्स ≠ पी)। साहित्य से ज्ञात ग्लाइकोसिलेशन रूपांकनों के साथ इन साइटों को पार मान्य है और परिणामों के दो पूल बनाने (मान्य है और सैद्धांतिक)। Deamidated और गैर-deamidated रूपों की बहुतायत की तुलना द्वारा एक दिया ग्लाइकोसिलेशन साइट का प्रतिशत अधिभोग की तुलना करने के वर्णक्रम मतगणना 30 का प्रयोग करें। 8. glycan सापेक्ष Quantitation नोट: निम्न पहचान और मात्रा का ठहराव Xcalibur सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पूरा किया गया। हालांकि, किसी भी सॉफ्टवेयर है कि कच्चे डेटा का विश्लेषण करती है और स्वचालित रूप से एकीकृत chromatographic चोटियों प्रतिस्थापित किया जा सकता है। hexoses, Deoxy-hexoses, hexosamines, सियालिक एसिड की जैविक रूप से संभव संयोजनों से glycan रचनाओं की एक सैद्धांतिक सूची, और अन्य SA उत्पन्नccharides। इस प्रयोजन के लिए, एक मानव glycan डेटाबेस एट अल। वाकर 15 द्वारा प्रकाशित किया गया है और के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। सैद्धांतिक डेटाबेस के लिए, प्रजातियों विशिष्ट जैविक बाधाओं मिश्रित अंतरिक्ष पर लगाया जाना चाहिए, और इन नियमों Kronewitter एट अल। 31 से वर्णित हैं। प्रोटॉन प्रभारी राज्यों + 1-3 के लिए प्रत्येक रचना के लिए परमाणु जनता से glycan monoisotopic जनता (एम) की गणना। monoisotopic जनता को संशोधित नेट (२५४.१४१९१ जी / मोल) या एसआईएल (२६०.१,६२,०४२ जी / मोल) P2GPN टैग के अलावा शामिल करने के लिए। Xcalibur में रोडमैप देखने से "प्रसंस्करण सेटअप" कार्यक्रम खोलें। एक प्रसंस्करण विधि बिल्कुल वाकर एट अल से पूरक सामग्री के रूप में वर्णित कदम 8.2 के लिए सैद्धांतिक monoisotopic जनता युक्त में उत्पन्न सूची का उपयोग कर सेट करें। 15 [एम एच +] 1+, [एम + 2H] 2 +, और [ एम + 3H] 3 + प्रजातियों। नोट: सटीक परे glycan पहचान की पुष्टि करने के लिएबड़े पैमाने पर, नेट / एसआईएल रन duplexed के लिए, जाँच करें कि नेट और एसआईएल एन -glycan जोड़े ही अवधारण समय के साथ सह Elute। गुणात्मक, एमएस 2 स्पेक्ट्रा के साथ पहचान पार मान्य, oxonium आयन श्रृंखला 32 से संबंधित चोटियों शामिल होना चाहिए जो। एक्सेल में एकीकृत, निकाले आयन chromatogram (XIC) निर्यात क्षेत्रों एसआईएल और नेट प्रचुरता बिल्कुल वाकर एट अल से पूरक सामग्री के रूप में वर्णित प्राप्त करने के लिए। 15 Excel में, कार्यक्रम एक नया स्तंभ कोशिकाओं में आणविक वजन ओवरलैप के लिए सुधार एसआईएल बहुतायत का समायोजन करके समीकरण वाकर एट अल द्वारा प्रकाशित के अनुसार गणना करने के लिए 1 से 5।: , जहां एक monoisotopic चोटी और सैद्धांतिक आइसोटोप ओवरलैप करते हैं, स्वतंत्र रूप से रचना प्रति गणना की जा सकती है। एक दूसरे कॉलम में, कार्यक्रम कोशिकाओं के रूप में वाकर एट अल द्वारा वर्णित, कुल सामान्यीकृत glycan कारक (TGNF) के लिए समीकरण का उपयोग कर, स्पेक्ट्रम प्रति नेट और एसआईएल चैनलों को सामान्य करने के लिए 1 से 5।: , जहां एन एन की संख्या गुणात्मक रूप से सीमा से ऊपर -glycans। एक नया कॉलम में, कार्यक्रम कोशिकाओं एसआईएल के अनुपात लेने के लिए: नेट ग्लाइकान (या इसके विपरीत) के दो नमूनों के बीच एकाग्रता में गुना परिवर्तन की गणना करने के लिए।

Representative Results

चित्रा 1:। संयुक्त प्रोटिओमिक्स और Glycomics विश्लेषण के लिए नुकीले-P2GPN हाइड्रोफोबिक टैगिंग मिलकर विधि की योजना (विधि एक) दिया जाता है कि कदम-Glycomics केवल प्रसंस्करण और मिलकर Glycomics और प्रोटिओमिक्स विश्लेषण, ग्लाइकोसिलेशन साइट पहचान के साथ बीच अलग, डाला जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। में लाइन प्रोटिओमिक्स और Glycomics, फिल्टर आधारित P2GPN हाइड्रोफोबिक टैगिंग विधि (विधि एक) की पहचान, quantitation, और आणविक वजन पूर्वाग्रह के लिए मान्य किया गया था जमा मुर्गी प्लाज्मा के नमूने (चित्रा 1) का उपयोग। पूरी तरह Glycomics प्रयोगों के लिए, एन की प्रचुरता में अंतर-तुलना विधि द्वारा निकाले -glycansएक spe (सोना-स्टैंडर्ड, विधि बी) बनाया गया (चित्रा 2) carbograph करने के लिए। वहाँ दो तरीकों के बीच ग्लाइकान की प्रचुरता में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे। एक ही विधि द्वारा निकाले ग्लाइकान की नेट अनुपात: इंट्रा-परिवर्तनशीलता भी एसआईएल बढ़ाता द्वारा मूल्यांकन किया गया था। दोनों तरीकों में से 2 लॉग -distributions, गाऊसी थे शून्य पर केंद्रित है, और काफी अलग नहीं (चित्रा 3 ए-बी)। आणविक वजन, दो प्रोटोकॉल पूरी तरह से छा बीच पर्वतमाला सुझाव है कि फिल्टर भेदभाव नहीं था एन आणविक वजन सीमा और hydrophilicity (चित्रा 4) के आधार पर -glycans। चित्रा 2:। नेट और एसआईएल एन की एक equimolar मिश्रण विधि एक या विधि बी द्वारा निकाले -glycans मुर्गी प्लाज्मा के 2.5 μl (एन = 4) नमूने थे गुदा से तैयार किया गया थाधारा 6 के लिए प्रत्येक glycan प्रचुरता में सुझाव दिया मानकों की सिफारिश, प्रत्येक नेट / एसआईएल चैनल में के अनुसार UPLC-एमएस द्वारा विश्लेषण किया, निकाले आयन chromatogram (एमएमए = 3 पीपीएम) के तहत क्षेत्र को एकीकृत करके गणना की गई आणविक के लिए संशोधन वजन ओवरलैप करते हैं, और TGNF द्वारा समायोजन। ये अनुपात उनके मानक त्रुटियों के साथ दिखाया गया है। विधि बी की प्रचुरता: विधि ए एन -glycans काफी अलग नहीं थे (p> 0.05)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3: (ए) विधि ए में इंट्रा-परिवर्तनशीलता (एन = 133) या (बी) विधि बी (एन = 123) रणनीतियों तुलना में था। नेट और एसआईएल एन -glycans की equimolar मिश्रण, एक ही निकासी योजना से, तीन तकनीकी प्रतिकृति के ऊपर विश्लेषण किया गया। लॉग 2 -distributions शून्य पर केंद्रित है और काफी अलग दो वर्कफ़्लोज़ के बीच। नहीं थे कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें। चित्रा 4: प्रत्येक रणनीति से ग्लाइकान की आणविक वजन पर्वतमाला की तुलना में थे। दो वर्कफ़्लोज़ ही आणविक वजन सीमा में फैले ग्लाइकान झुकेंगे। एन एक प्रोटोकॉल में पता चला -glycans बनाम अन्य बस का पता लगाने (1 × 10 5 बहुतायत) की सीमा से ऊपर गिर गया और व्यवस्थित पूर्वाग्रह को प्रतिबिंबित नहीं करते। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण। <p class="jove_content" fo:keep-together.भीतर-पेज = "1"> आणविक वजन फिल्टर द्वारा deglycosylated प्रोटीन में लाइन सक्षम proteome विस्तृत विश्लेषण और ग्लाइकोसिलेशन साइट पहचान की अवधारण। ग्लाइकान और प्रोटीन की संयुक्त शुद्धि के लिए एकाधिक प्रोटोकॉल deglycosylation (5 तालिका) के बिना एक पारंपरिक FASP तैयारी की तुलना में थे। हमारे ठेठ 18 घंटा फिल्टर आधारित PNGase एफ पाचन, FASP trypsin डाइजेस्ट (एसटीडी प्रोटोकॉल) के बाद गैर विशिष्ट deamidation के महत्वपूर्ण स्तर है, जो glycosites की पहचान के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं में हुई। इसलिए, एक विधि ऊंचा तापमान (50 डिग्री सेल्सियस) और एक PNGase एफ कील में कदम (एसपीआई प्रोटोकॉल) पर एक छोटी ऊष्मायन समय का उपयोग, एक विकल्प के रूप में पता लगाया गया था एक माइक्रोवेव पाचन प्रोटोकॉल (एमडी प्रोटोकॉल) के साथ-साथ गैर कम करने के लिए विशिष्ट deamidation। ग्लाइकान नई पाचन तरीकों में मनाया, रचनाओं या मानक 18 घंटा से प्रचुरता में काफी अलग नहीं थे 37 डिग्री सेल्सियस फिल्टर PNGase एफ डाइजेस्ट ( <strong> चित्रा 5)। एक छोटी trypsin ऊष्मायन के साथ संयुक्त, गैर विशिष्ट deamidation काफी glycosites <5% (5 तालिका) के लिए एक झूठी सकारात्मक दर के साथ कम हो गया था। प्रोटीन पेप्टाइड्स Deamidated पेप्टाइड्स Glycosites ग्लाइकोप्रोटीन + – + – + – + – + – FASP <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1,029 733 257 24 112 18 एमडी 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 एसपीआई 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8 । तालिका 5: एक मानक trypsin से प्रोटिओमिक डेटा की तुलना पचाने बनाम में लाइन नुकीले-P2GPN टैगिंग विधि किए गए थे तैयारी के साथ प्रदर्शन किया गया (+) और बिना (-) PNGase एफ गैर विशिष्ट deamidation और अनुमान की पृष्ठभूमि दरों का निर्धारण करने के लिए झूठी सकारात्मक दरों glycosite। प्रोटीन 1% झूठे खोज दर (एफडीआर) के साथ की पहचान कर रहे थे; पेप्टाइड्स पर "उच्च" Proteome करनेवाला 1.4 में पेप्टाइड विश्वास आधारित फ़िल्टर किया गया (क्यू <0.01); glycosites identifi थेएड संरक्षित ग्लाइकोसिलेशन मूल भाव (NXS / टी) के deamidation युक्त अद्वितीय दृश्यों पर आधारित है; और ग्लाइकोप्रोटीन पहचान प्रोटीन कम से कम एक पहचान glycosite युक्त के रूप में परिभाषित किया गया। चित्रा 5: ग्लाइकान के लिए छोटा प्रोटोकॉल नमूनों में deamination कम करने के लिए विकसित की है और 18hr नुकीले PNGase एफ डाइजेस्ट की तुलना में थे। प्रचुरता में मतभेद औसत 10% और एमडी (2.2.3) और एसपीआई (2.2.2) प्रोटोकॉल के लिए क्रमश: 5% थे। पहचान 48 ग्लाइकान में से 90% 1.5 गुना भिन्नता से कम है। दिखाया गया कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with ¹⁸O labeling of Asn during the PNGase digestion step^22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Materials

Acetic Acid (50%):	Sigma Aldrich	45754
Acetonitrile, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH015-4
Ammonium Bicarbonate	Sigma Aldrich	A6141
Bradford Reagent	Sigma Aldrich	B6916	Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016
Centrifuge	Eppendorf	5804 R	Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution	Sigma Aldrich	646563
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack	TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens	Fisher Scientific	11-690-625F	Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid	Sigma Aldrich	56302
GE Microwave Oven	General Electric	57B5 E82904	Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase	Phenomenex	Bulk Media	Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM
Mascot Daemon Software and Server	Matrix Science		Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm	New Objective	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific		Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B	New England Biolabs	P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas	Sigma Aldrich	T6567-5X
Urea	Sigma Aldrich	51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	SPD131DDA	Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH365-4
Water, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit	Merck Millipore	693030