Kortikal Actin Flow i T-celler kvantificeret ved Spatio-temporale billede Korrelation spektroskopi af Struktureret Illumination Microscopy data
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
Filamentøs-actin spiller en afgørende rolle i et flertal af celleprocesser, herunder motilitet, og i immunceller, dannelsen af en central celle-celle interaktion kendt som den immunologiske synapse. F-actin er også spekuleret at spille en rolle i reguleringen af molekylære fordelinger på membranen af celler, herunder sub-membranøs vesikel dynamik og protein klyngedannelse. Mens standard lysmikroskop teknikker gør det muligt generaliserede og diffraktionsbegrænset observationer der skal foretages, opstår mange cellulære og molekylære begivenheder, herunder klyngedannelse og molekylær flow i populationer Omsider-skalaer langt under opløsningsevne af standard lysmikroskopi. Ved at kombinere total intern refleksion fluorescens med super opløsning billeddannelse metode struktureret belysning mikroskopi blev den todimensionale molekylær strømning af F-actin på immune synapse af T-celler registreres. Spatio-temporale billede korrelation spektroskopi (STICS) blev derefter anvendt, som genererer kvantificerbare results i form af hastighed histogrammer og vektorkort repræsenterer flow direktionalitet og størrelse. Denne protokol beskriver kombinationen af super-opløsning billeddannelse og STICS teknikker til at danne flow vektorer ved sub-diffraktion niveauer af detaljer. Denne teknik blev anvendt til at bekræfte en actin strøm, som er symmetrisk retrograd og centripetale hele periferien af T-celler ved synapsedannelse.
Introduction
Målet med forsøget er at billedet og karakterisere den molekylære strøm af filamentous- (F-) actin i levende T-celler, uden diffraktionsgrænsen med henblik på at etablere flow retning og størrelse under immunologisk synapse (IS) formation. Denne teknik vil blive gennemført ved hjælp af en struktureret belysning mikroskop (SIM) i total indre refleksion fluorescens (TIRF) tilstand, billeddannelse Jurkat T-celler, der er en kunstig synapse om aktivering dækglas overtrukket med anti-CD3- og anti-CD28 antistoffer. IS formularer mellem en T-celle og dens mål; en antigenpræsenterende celle (APC) ved T-celle receptor (TCR) aktivering 1,2. Da dette er det første skridt i at afgøre, om det adaptive immunsystem genererer en immunreaktion mod en infektion, kan konsekvenserne af ukorrekt reaktion på stimuli forårsager en række sygdomme. Betydningen af T-celle-APC interaktion er veldokumenteret, dog rolle (r) i det modne IS efter indledende TCR signal internalisering er endnu ikke fuldt forstået.
Som cytoskelettet menes at støtte to processer knyttet til TCR-aktivering (bevægelsen af molekyler på plasmamembranen og kontrollen med signalmolekyler afhængige actincytoskelettet 3,4), forstå, hvordan cytoskelettet omarrangerer rumligt og tidsligt vil belyse trinene molekylær reorganisering under synapsedannelse. Retrograd strømning af F-actin menes at corral TCR klynger mod midten af det immunologiske synapse, er denne translokation menes at være afgørende for signal ophør og genbrug; medvirken den fine balance i T-celle aktivering 5.
Mens standard fluorescens mikroskopi er et fleksibelt værktøj, der fortsætter med at give indsigt om mange biologiske begivenheder, herunder celle-celle-interaktioner, er det begrænset af systemets evne til præcist at løse flere fluoroforer bopæl tættere end diffrhandling grænse (≈200 nm) af hinanden. Da mange molekylære begivenheder inden celler involverer tætte bestande af molekyler og udviser dynamisk omlægning enten i hvile eller efter specifik stimulering, er konventionel lysmikroskopi ikke giver det fulde billede.
Anvendelsen af super opløsning billeddannelse har tilladt forskere til at omgå diffraktionsgrænsen anvendelse af en række teknikker. Enkelt molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM), såsom Palm og STORM 6,7 har evnen til at løse placering af molekyler op til en nøjagtighed på ca. 20 nm, men disse teknikker afhængige af lange erhvervelsestider, opbygge et billede over mange rammer . Generelt kræver dette prøver, der skal faste eller til strukturer til at udvise lav mobilitet så enkelt fluoroforer ikke misforstås som flere point. Mens stimuleret emission depletion (STED) billedbehandling giver super opløsning gennem meget selektiv konfokal excitation 8, den krævede scanningtilgang kan være langsom i løbet af hele celler synsfelter. STED viser også betydelige fototoksicitet for højere opløsninger på grund af stigningen i magt nedbrydningen stråle.
Struktureret belysning mikroskopi (SIM 9) er et alternativ til disse metoder, i stand til at fordoble opløsningen af en standard fluorescens mikroskop og er mere kompatibel med levende celler end de nuværende SMLM teknikker. Det bruger lavere laser beføjelser, på en lang-felt for hel-celle synsfelter; sikrer øget erhvervelse hastigheder, og er kompatibel med standard fluorophor mærkning. Vidvinkelbilledet karakter SIM tillader også anvendelsen af total indre refleksion fluorescens (TIRF) for meget selektiv excitation, med indtrængningsdybder i den aksiale dimension <100 nm.
Billede korrelation spektroskopi (ICS) er en metode til at korrelere variationer i fluorescensintensitet. En videreudvikling af ICS; Spatio-temporale imalder korrelation spektroskopi (STICS 10) korrelerer intracellulære fluorescerende signaler i tid og rum. Ved at korrelere pixel intensiteter med omgivende pixels i tilbagestående rammer via en korrelationsfunktion, der får kendskab om flow hastigheder og retningsbestemmelse. For at sikre statiske objekter ikke forstyrrer STICS analyse, en immobil objekt-filter implementeret, som fungerer ved at trække et glidende gennemsnit af de pixel intensiteter.
Teknikken præsenteres her menes at være den første demonstration af billedet korrelation spektroskopi anvendes til super-opløsning mikroskopi data at kvantificere den molekylære flow i levende celler 11. Denne metode forbedrer diffraktionsbegrænset billeddannelse af F-actin flow via STICS analyse 12 og ville passe forskere, der ønsker at bestemme todimensional molekylær flow i levende celler, fra data indhentet ved rumlige opløsninger ud diffraktionsgrænsen af lys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne teknik vil give forskere til billedet og kvantificere tidligere uløselige detaljer i celler, der udtrykker fluorescens. I vores resultater viser vi, at F-actin flyder på en symmetrisk måde fra cellen periferien mod midten af cellen i T-cellen IS. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere resultater fra 1D line profil kymograph data 13 og udvide kapaciteten af analysen til 2D og data super-opløsning.
De præsenterede teknik er en progression fra kymograph…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
