تقييم خصوصية المضاد للسرطان المخدرات<em> في المختبر</em
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو تقييم خصوصية الأدوية المضادة للسرطان في المختبر باستخدام الثقافات المختلطة التي تحتوي على خلايا الورم على حد سواء وغير السرطانية.
Abstract
ويتجلى إجراء لتقييم خصوصية الأدوية المضادة للسرطان في المختبر باستخدام الثقافات تحتوي على كل ورم وغير ورم الخلايا. العنصر الرئيسي هو تحديد كمية من التعديل الوراثي للورم محددة فيما يتعلق تسلسل عالمي باستخدام ثنائي التحقيق الرقمي فحص PCR وحساب لاحق من نسبة الخلايا السرطانية. ويتم فحص الخروج على الثقافة التي تحتوي على الخلايا السرطانية وجود خط أنشئت وارتفعت في الخلايا غير السرطانية. يتم التعامل مع ثقافة مختلطة مع المخدرات اختبار بتركيزات مختلفة. بعد العلاج، ويتم إعداد الحمض النووي مباشرة من خلايا لاصقة على قيد الحياة في الآبار لوحات 96-جيدا باستخدام طريقة بسيطة وغير مكلفة، وتعرض لثنائي التحقيق الرقمي فحص PCR لقياس التغيير الجيني للورم معين وتسلسل عالمي المرجعية . في مظاهرة الحالية، يتم استخدام الحذف متخالف من الجين NF1 مثل التعديل الوراثي للورم معين وجين RPP30 كما الجين المرجعية. باستخدام نسبة NF1 / RPP30، تم احتساب نسبة الخلايا السرطانية. منذ التغيير تعتمد على الجرعة من نسبة الخلايا السرطانية يوفر دلالة في المختبر لخصوصية المخدرات، وهذا في الفحص المختبري وراثية وخلية القاعدة المرجح أن يكون إمكانيات التطبيق في اكتشاف الأدوية. وعلاوة على ذلك، لرعاية مرضى السرطان، شخصية، يمكن أن تسهم هذه الأداة genetic- وخلية القاعدة إلى تحسين العلاج الكيميائي عن طريق اختبار فعالية وخصوصية المخدرات مرشح باستخدام الثقافات الأولية من ورم على حدة.
Introduction
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الأساسية في هذه الأداة genetic- وخلية القاعدة لتقييم خصوصية المخدرات في المختبر هي تحديد نسبة الخلايا السرطانية باستخدام واحد أو أكثر من الخصائص الوراثية للورم معين. وعلى النقيض من ميزات المظهرية التقليدية 7، الميزات الوراثية هي محددة ومستقرة وسهلة لقياس. على سبيل المثال، فإن الطفرة أو عدد النسخ الاختلاف ورم محددة موجودة حصرا في الخلايا السرطانية ولكن ليس في الخلايا غير السرطانية. هذا وصمة عار وراثي يمكن أن يعتمد عليه وعلى وجه التحديد كميا، على سبيل المثال، وذلك باستخدام PCR الرقمي كما هو موضح في هذه الدراسة.
لPCR الرقمي، نقاء عالية من الحمض النووي ليست ضرورية. ومع ذلك، تحلية وإزالة الجزيئات المثبطة هي اللازمة التي يمكن تحقيقها عن طريق على بعد غسيل الكلى انخفاض استخدام مرشح مناسب. وجنبا إلى جنب تحلل وانخفاض غسيل الكلى هو بسيط وسريع، لا يتطلب أي أدوات خاصة، وبالتالي يمكن أن تنفذ في أي مختبر القياسية. إذا كانت الخلايا لا برياك جيدا، يمكن اعتبار معالجة إضافية مثل تجميد الخلايا في -20 درجة مئوية، مضيفا المنظفات و / أو باستخدام البروتيني.
في هذه الدراسة، تم استخدام الحذف متخالف من الجين NF1 كسمة ورم محددة لتقدير. وبالمثل، الحذف من الجينات أو مواضع أخرى يمكن أن تستخدم أيضا. وعلاوة على ذلك، والطفرات يمكن أن تستخدم أيضا لقياس الخلايا السرطانية. في هذه الحالة، لا بد من التحقق من صحة نطاق واسع لضمان خصوصيتها لكل منهما المقايسات PCR الرقمية لمتحولة والأليلات العادية.
نسبة تعتمد على جرعة من الخلايا السرطانية توفر مؤشرا عن المخدرات خصوصية أو الانتقائية. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أيضا استجابة استخراج الخلايا السرطانية من الاستجابة من مجموع الخلايا ثقافة مختلطة لدواء (الشكل 4). وتنص هذه الاستراتيجية استخراج حل للمشكلة فنية في استخدام الثقافات الأولية (التي تحتوي على كل ورم وليسخلايا ن الورم) لمكافحة المخدرات والاختبار.
وgenetic- وخلية مقرها في أداة المختبر تبين في هذه الدراسة وبالتالي تكون هناك إمكانية التطبيق (1) في مجال مكافحة المخدرات اكتشاف حيث أنه يوفر منصة لتقييم خصوصية المخدرات أو الانتقائية في المختبر و (2) في رعاية مرضى السرطان شخصية حيث تمكن المخدرات اختبار في الثقافات الأولية، وبالتالي يمكن أن تسهم في المخدرات التحديد في مساعد العلاج الكيميائي 4. وعلاوة على ذلك، وآلية الدوائية للدواء يمكن دراستها باستخدام هذه الأداة، منذ بعض التعديل الوراثي أو تغيرات جينية متعددة يمكن اتباعها أثناء المخدرات العلاج.
وثمة صعوبة في استخدام الثقافات الأولية الفردية هي عدم وجود ميزة وراثية عالمية لتقدير حجم الخلايا السرطانية. ومع ذلك، مع التقدم اليوم في تسلسل كامل الجينوم، من المعروف أن الجينات والمناطق الأكثر غيرت في كثير من الأحيان لعلاج الأورام شيوعا. على سبيل المثال، بين الرأس والعنقالأورام، 71٪، 23٪ و 22٪ لديهم طفرات في TP53، FAT1 والجينات CDKN2A، و 60٪، 34٪ و 26٪ لديهم الحذف في المناطق الجينات من CDKN2A، STK11 وPTEN، على التوالي 10. فحص 5-10 هذه الجينات و / أو المناطق عن طريق استهداف التسلسل أو / و PCR الرقمي وبالتالي من المحتمل تحديد واحد أو أكثر من التعديلات الوراثية التي يمكن استخدامها لتقدير حجم الخلايا السرطانية في الثقافة الأولية المشتقة. الحد آخر هو المبلغ في كثير من الأحيان غير كافية من الأورام مقطوعة لإقامة الثقافات الأولية.
وعلى الرغم من ميزات مفيدة وإمكانية تطبيق واعدة للgenetic- وخلية مقرها في أداة المختبر، يجب أن تبقى حدودها في الاعتبار، وينبغي التأكيد في المختبر الطبيعة. على سبيل المثال، فإن الآثار التفاضلية أو السمية الخلوية للدواء على الخلايا السرطانية قد بدلا نظرا للاختلاف في أنواع الخلايا (الخلايا الليفية مقابل خلايا شوان) أو منأصول مختلفة (من مختلف الأفراد). ويمكن أيضا أن أوضح تأثير أقوى من الدواء على الخلايا السرطانية من على الخلايا غير السرطانية، من خلال حقيقة أن تنمو السابق أسرع من هذا الأخير. الأهم من ذلك، الخلايا في المختبر السلوك يختلف من الخلايا في جسم الإنسان، وبالتالي، نتائج التقييم في المختبر في كثير من الأحيان لا أو جزئيا فقط تعكس الحالة السريرية الحقيقي. لذلك، فعالية، سمية الخلايا وخصوصية المخدرات التي تم الحصول عليها عن الخلايا المستزرعة هي بالأحرى من طبيعة العلامات البيولوجية لكنها لا تملك مصداقية فعالية قياس preclinically من المضادات الحيوية. ومع ذلك، والانتقال من خطوط الخلايا على الثقافات المختلطة و / أو الثقافات الأولية هو خطوة إلى الأمام في تقييم المخدرات تأثير وخصوصية / الانتقائية في المختبر. مع جهود واسعة النطاق، في ظروف المختبر ويمكن الاطلاع التي تمكن ارتباط معقول في المختبر البيانات مع استجابات حقيقية للمرضى، على الأقل بالنسبة لبعض الأدوية.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تحظى بتقدير السيدة ألستر، السيد Honrath والدكتور جيانغ للحصول على المساعدة الفنية المعلقة بينهما. يقدر أيضا هو الدكتور فولز وفريق البحث الدكتور Dandri إلى توفير إمكانية الوصول إلى جهاز PCR الرقمي الخاص بها.
Materials
| membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).
- McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Edwards, A. M., et al. Preclinical target validation using patient-derived cells. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).
- Frahm, S., et al. Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients. Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).
- Jiang, W., et al. Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro. J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).
- Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures. J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).
- Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).
- Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
- Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).
