Выделение CD146⁺ Resident легких мезенхимальных стромальных клеток крысы легких

Summary

Этот протокол описывает методику изоляции для получения мезенхимальных стромальных клеток первичных резидентные легких у крыс, посредством использования ферментативного расщепления, разделения в градиенте плотности, пластической адгезии и CD146 ⁺ магнитного отбора борта.

Abstract

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) получают все большее признание за их терапевтический потенциал в широком спектре заболеваний, в том числе заболеваний легких. Кроме того, использование костного мозга и пуповинной МСК шнур для экзогенной клеточной терапии, там также растет интерес к ремонту и регенеративный потенциал МСК резидентов тканей. Кроме того, они, вероятно, играют определенную роль в нормальном развитии органов и были приписаны роли в болезни, особенно с фиброзной природой. Основным препятствием для изучения этих МСК резидентов ткани является отсутствие четкой маркера для выделения и идентификации этих клеток. Метод выделения описано здесь применяется несколько характеристик МСК резидентов легких (L-МСК). После умерщвления крыс, легкие удаляют и промывают несколько раз, чтобы удалить кровь. После механической диссоциации скальпелем, легкие перевариваются в течение 2-3 ч, используя комбинацию типа коллагеназы I, нейтральной протеазы и типа ДНКазы И. obtaineд сингл клеточную суспензию затем промывали и наслаивали на градиент плотности среде (плотность 1,073 г / мл). После центрифугирования клетки из интерфазы промывают и высевают в культуральных колбах обработанных. Клетки культивировали в течение 4-7 дней в физиологическом 5% O _2, 5% СО ₂ условия. Чтобы истощить фибробласты (CD146 ^-) и обеспечить население только L-МСК (CD146 ^+), позитивной селекции для CD146 ^{+ клеток} осуществляется через магнитное отбора борта. Таким образом, эта процедура надежно производит население первичной L-МСК для дальнейшего изучения и манипулирования в пробирке. Из-за природы протокола, он может быть легко переведено в других экспериментальных моделях на животных.

Introduction

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) получают все большее признание за их терапевтический потенциал в широком спектре заболеваний, в том числе заболеваний легких. Кроме того, использование костного мозга и пуповинной МСК шнур для экзогенной клеточной терапии, там также растет интерес к ремонту и регенеративный потенциал МСК резидентов тканей. Во время разработки, в том числе в легких, мезенхима является важным источником сигналов развития и резиденты МСК являются вероятным кандидатом, чтобы быть в центре этого. Кроме того, доказательства вытекает что МСК резиденты возмущается у взрослых заболеваний, в том числе рака ^1,2 и фиброза ^3. Основным препятствием для изучения этих МСК резидентов ткани является отсутствие четкой маркера для выделения и идентификации этих клеток ^4. Стволовыми клетками антигена-1 (Sca-1) был идентифицирован у мышей в качестве маркера для различных стволовых клетках тканевой, и может быть использован для изоляции L-МСК ^5, но имеет, к сожалению,нет известных ортологи у других видов ^6. Исследователи сообщили различные методы изоляции для изоляции L-МСК с любой ткани легкого или жидкости. Они варьируются от клеток с возбуждением флуоресценции сортировки (FACS), основанные методы селекции CD31 ^– / CD45 ^– / CD90 ⁺ клетки ^7, CD31 ^– / CD45 ^– / эпителиальных молекула клеточной адгезии (EpCAM) – / SCA-1 + клеток ^8, множественная лекарственная устойчивость транспортер АТФ связывающего кассетного G (ABCG2) позитивные клетки ⁹ или Hoechst 33342 отток красителя ^10, к пластической присоединения ^11,12 и миграции из рубленого ткани ^13.

Преимущества настоящего документа представлены метода несколько раз. При использовании нежный ферментативного расщепления и градиент ¹⁴ плотности, получаем все клетки диапазоне плотностей, которые включают МСК, но исключают эпителиальные или эндотелиальные клетки. Последующее пластиковые шаг соблюдение гарантирует, что только mesenchymal клетки придерживаться и остаться в культуре, устраняя лейкоциты. Но самое главное, этап выбора CD146 ⁺ позволяет устранить фибробластов, так как эти клетки не экспрессируют CD146. Экспрессия молекул клеточной адгезии CD146 положительно коррелирует с мультипотентность, и поэтому является хорошим маркером, чтобы отсеять фибробласты из популяции мезенхимальных клеток ^15-19. Это является преимуществом по сравнению с использованием CD90 качестве селективного маркера, как это выражается не только в МСК, но также и в lipofibroblasts ^5,20. В этом протоколе мы явно выбраны магнитное выбор шарик, как это мягче на клетках, и вся процедура может быть сделано в стерильных условиях. Другим важным преимуществом этого способа выделения, в отличие от метода выроста, является то, что сравнительно быстро, 6-10 дней, в отличие от месяца или более для метода вырост. От трех до пяти дней после первоначальной изоляции популяция мезенхимальных готов к CD146 ⁺ Селе ие; еще через три-пять дней CD146 ⁺ клетки готовы для использования в экспериментах или могут быть заморожены для дальнейшего использования. Уменьшилось время культуры улучшает качество клеток, как МСК трансдифференцироваться направлении фибробластов в длительной экс естественных культуры ^19. Наконец, из-за природы протокола, можно применить этот метод к другим видам просто выбрав соответствующие антитела, или даже другие системы органов, регулируя выбор пищеварения ферментов и времени инкубации.

Подробный протокол такого способа выделения приводится ниже, и схематическое представление выделения и последующего отбора CD146 ⁺ субпопуляции обеспечивается на фиг.1А и 1В соответственно. Кроме того, данные включены для пассирования, замораживания и оттаивания эти клетки.

Объявление / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема обзор изоляции легочных клеток мезенхимальных (А) и последующей CD146 ⁺ клеточной селекции (B) = мин минут. ЭДТА = этилендиаминтетрауксусная кислота; ^2-й Ab = вторичное антитело; альфа-CD146 AB = первичное антитело анти-CD146; ве клетки = CD146 негативные клетки; положительной клетки = CD146-положительные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Protocol

Все процедуры были одобрены Animal Care комитета Университета Оттавы (протокол животное этика Ohří-1696) по. Уход за животными проводили в соответствии с ведомственным руководящим принципам. 1. Выделение легких мезенхимальных стромальных клеток Подготовьте смеси фермент…

Representative Results

Два из наиболее надежных физических характеристик МСК, плотности и пластиковой присоединения, используются в первой части этого протокола для получения мезенхимальных клеточной фракции легкого, который содержит L-МСК. Хотя градиент плотности межфазного войдут моно?…

Discussion

Выделение и культура первичной L-МСК дает возможность лучше понять их функции и их взаимодействие с другими клеточных популяций на клеточном уровне, и их роль в развитии легких, здоровья и болезни. Это особенно важно, поскольку отсутствие конкретного одного маркера этих клеток делает п…

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC