Isolamento di CD146⁺ cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica di isolamento per ottenere cellule mesenchimali stromali residenti polmonare primaria da ratti, attraverso l'uso di digestione enzimatica, la separazione gradiente di densità, aderenza plastica e CD146 ⁺ selezione perlina magnetica.

Abstract

Mesenchimali cellule stromali (MSC) sono sempre più riconosciuti per il loro potenziale terapeutico in una vasta gamma di malattie, comprese le malattie polmonari. Oltre l'uso di midollo osseo e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale per la terapia cellulare esogena, vi è anche un crescente interesse per la riparazione e la potenziale rigenerativo delle cellule staminali mesenchimali del tessuto residenti. Inoltre, essi hanno probabilmente un ruolo nello sviluppo normale dell'organo, e sono stati attribuiti ruoli nella malattia, in particolare quelli di natura fibrotica. L'ostacolo principale per lo studio di queste MSC tissutali residenti è la mancanza di un chiaro indicatore per l'isolamento e l'identificazione di queste cellule. La tecnica di isolamento qui descritta si applica molteplici caratteristiche di MSC residenti del polmone (L-MSC). Al sacrificio dei ratti, polmoni vengono rimossi e risciacquati più volte per rimuovere il sangue. Dopo la dissociazione meccanica bisturi, i polmoni sono digeriti per 2-3 ore utilizzando un mix di tipo collagenasi I, proteasi neutra e il tipo di DNasi I. Il richiederlod singola sospensione cellulare viene successivamente lavato e stratificato su gradiente di densità media (densità 1,073 g / ml). Dopo centrifugazione, le cellule dal interfase vengono lavati e piastrate in fiasche di coltura trattato. Le cellule sono coltivate per 4-7 giorni in fisiologico 5% O _2, 5% _di CO 2 condizioni. Per esaurire fibroblasti (CD146 ^-) e di garantire una popolazione di soli L-MSC (CD146 ^+), selezione positiva per le cellule CD146 ⁺ avviene attraverso la selezione perla magnetica. In sintesi, questa procedura produce affidabile una popolazione di primaria L-MSC per ulteriori studi e la manipolazione in vitro. A causa della natura del protocollo, può facilmente essere tradotto ad altri modelli animali sperimentali.

Introduction

Mesenchimali cellule stromali (MSC) sono sempre più riconosciuti per il loro potenziale terapeutico in una vasta gamma di malattie, comprese le malattie polmonari. Oltre l'uso di midollo osseo e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale per la terapia cellulare esogena, vi è anche un crescente interesse per la riparazione e la potenziale rigenerativo delle cellule staminali mesenchimali del tessuto residenti. Durante lo sviluppo, anche nel polmone, mesenchima è una fonte importante di spunti di sviluppo, e MSC residenti sono un probabile candidato per essere al centro di questo. Inoltre, la prova sta emergendo che le MSC residenti siano disturbati in malattie degli adulti, tra cui il cancro ^1,2 e fibrosi ^3. L'ostacolo principale per lo studio di queste MSC tissutali residenti è la mancanza di un chiaro indicatore per l'isolamento e l'identificazione di queste cellule ^4. Stem cell antigen-1 (Sca-1) è stato identificato nei topi come marker per una varietà di cellule staminali dei tessuti, e può essere utilizzato per l'isolamento di L-MSC ^5, ma ha purtroppoNon si conoscono ortologhi in altre specie ^6. I ricercatori hanno riportato una varietà di metodi di isolamento per l'isolamento di L-MSC sia da tessuto polmonare o fluido. Questi variano da cellule attivate a fluorescenza (FACS) metodi basati selezione per CD31 ^– / CD45 ^– / CD90 ⁺ cellule ^7, CD31 ^– / CD45 ^– / epiteliale molecola di adesione delle cellule (EpCAM) – Sca-1 + cellule ⁸ /, multidrug resistance trasportatore ATP cassette legame G (ABCG2) cellule positive ⁹ o colorante Hoechst 33342 efflusso ^10, per l'aderenza plastica ^11,12 e la migrazione fuori del tessuto tritato ^13.

I vantaggi del metodo qui presentato sono diverse volte. Usando una digestione enzimatica dolce e gradiente di densità ^14, si ottengono tutte le celle della gamma di densità che includono MSC ma escludono cellule epiteliali o endoteliali. La successiva fase di adesione in plastica garantisce che solo il mesenchcellule ymal aderiscono e rimanere nella cultura, eliminando leucociti. Più importante, tuttavia, la fase di selezione CD146 ⁺ permette l'eliminazione dei fibroblasti, come queste cellule non esprimono CD146. L'espressione della molecola di adesione delle cellule CD146 è correlata positivamente con multipotenza, ed è quindi un buon indicatore per eliminare i fibroblasti da una popolazione di cellule mesenchimali ^15-19. Questo è un vantaggio rispetto all'utilizzo CD90 come marcatore di selezione, in quanto non solo è espresso in MSC ma anche in lipofibroblasts ^5,20. In questo protocollo abbiamo scelto esplicitamente una selezione perlina magnetica, in quanto è più delicato sulle cellule, e l'intero procedimento può essere realizzata in condizioni sterili. Un altro importante vantaggio di questo metodo di isolamento rispetto al metodo conseguenza, è che è relativamente veloce, 6-10 giorni al contrario di un mese o più per il metodo di conseguenza. Da tre a cinque giorni dopo l'isolamento iniziale popolazione mesenchimale è pronto per CD146 ⁺ sele ction; dopo altri tre a cinque giorni le cellule CD146 ⁺ sono pronti per essere utilizzati negli esperimenti o possono essere congelati per un uso successivo. Il tempo di diminuzione della cultura migliora la qualità delle cellule come MSC transdifferenziare verso fibroblasti in prolungata coltura ex vivo ^19. Infine, a causa della natura del protocollo, è possibile applicare questo metodo ad altre specie semplicemente scegliendo anticorpi appropriati, o anche ad altri sistemi organici regolando la scelta di enzimi digestivi e tempo di incubazione.

Un protocollo dettagliato di questo metodo di isolamento è dato seguito, e una visione schematica del isolamento e la successiva selezione della sottopopolazione CD146 ⁺ è fornito in Figura 1A e 1B rispettivamente. Inoltre, i dettagli sono inclusi per passaging, congelamento e scongelamento queste cellule.

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Figura 1. Schema di isolamento di cellule polmonari mesenchimali (A) e la successiva CD146 ⁺ selezione cella (B) min = minuti.; EDTA = etilendiamminotetraacetico; ² ° Ab = anticorpo secondario; alfa-CD146 Ab = primaria anticorpo anti-CD146; ve le cellule CD146 = cellule negative; + ve cellule positive cellule CD146 =. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Animal Care dell'Università di Ottawa (animale protocollo etica í-1696). Cura degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali. 1. Isolamento di cellule polmonari mesenchimali stromali Preparare la miscela di enzimi in un tubo da 50 ml: pesare 30 U proteasi neutra, 2.500 U Collagenasi I e 500 U DNAsi I. Tali importi sono sufficienti per i polmoni di un topo adulto o dei ratti. Preparare il …

Representative Results

Due delle caratteristiche fisiche più affidabili di MSC, densità e aderenza plastica, sono utilizzati nella prima parte di questo protocollo per ottenere la frazione di cellule mesenchimali del polmone che contiene L-MSC. Sebbene l'interfase gradiente di densità comprenderà monociti e macrofagi, oltre alle cellule mesenchimali del polmone, l'aderenza plastica seguita da 3-5 giorni di coltura garantisce che solo le cellule mesenchimali del polmone rimangono. In effetti questa …

Discussion

L'isolamento e la coltura di primaria L-MSC offre l'opportunità di comprendere meglio la loro funzione e la loro interazione con le altre popolazioni cellulari a livello cellulare, e il loro ruolo nello sviluppo del polmone, della salute e della malattia. Ciò è particolarmente importante in quanto la mancanza di uno specifico singolo marcatore di queste cellule rende quasi impossibile studiare queste cellule in situ. Come per tutte le popolazioni cellulari primarie, si dovrebbe tenere a mente che que…

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC