Isolering av CD146⁺ Resident Lung mesenkymala stromaceller celler från råttlungor

Summary

Detta protokoll beskriver en isolerings teknik för att erhålla primära lung bosatta mesenkymala stromaceller från råttor, genom användning av enzymatisk nedbrytning, densitetsgradient separation, plast vidhäftning och CD146 ⁺ magnetisk pärla urval.

Abstract

Mesenkymala stromaceller (MSC) är i allt större utsträckning för deras terapeutiska potential i ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive lungsjukdomar. Förutom användning av benmärg och navelsträngs MSCs för exogen cellterapi, finns det också ett ökat intresse för reparation och regenerativ potential bosatta vävnads MSC. Dessutom är de sannolikt har en roll i normal organutveckling, och har tillskrivits roller i sjukdomar, särskilt de med en fibrotisk natur. Den främsta hindret för studier av dessa bosatta vävnads MSC är bristen på en tydlig markör för isolering och identifiering av dessa celler. Isoleringen teknik som beskrivs här gäller flera egenskaper hos lung bosatta MSC (L-MSC). Vid offer råttorna, är lungorna avlägsnas och sköljs flera gånger för att tvätta bort blodet. Efter mekanisk dissociation av skalpell, är lungorna digererades under 2-3 h med användning av en blandning av kollagenas typ I, neutralt proteas och DNase typ I. obtained enkelcellsuspension tvättas därefter och skiktades över densitetsgradient-medium (densitet 1,073 g / ml). Efter centrifugering, är celler från interfas tvättades och ströks ut i odlingsbehandlade kolvar. Cellerna odlas under 4-7 dagar i fysiologisk _5% O2, _5% CO2 villkor. Att utarma fibroblaster (CD146 ^-) och för att säkerställa en population av endast L-MSC: er (CD146 ^+), positiv selektion för CD146 ^{+ -celler} utförs genom magnetisk pärla val. Sammanfattningsvis, detta förfarande på ett tillförlitligt sätt ger en population av primär L-MSC för vidare in vitro-studier och manipulation. På grund av arten av protokollet, kan det lätt översättas till andra experimentella djurmodeller.

Introduction

Mesenkymala stromaceller (MSC) är i allt större utsträckning för deras terapeutiska potential i ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive lungsjukdomar. Förutom användning av benmärg och navelsträngs MSCs för exogen cellterapi, finns det också ett ökat intresse för reparation och regenerativ potential bosatta vävnads MSC. Under utveckling, bland annat i lungan, är mesenkym en viktig källa till utvecklings ledtrådar, och bosatta MSC är en trolig kandidat för att stå i centrum för detta. Dessutom är bevis fram som bosatta MSC störs hos vuxna sjukdomar, inklusive cancer ^1,2 och fibros ^3. Den främsta hindret för studier av dessa bosatta vävnads MSC är bristen på en tydlig markör för isolering och identifiering av dessa celler ^4. Stamcellantigen-1 (Sca-1) identifierades i möss som en markör för en mängd olika vävnads stamceller, och kan användas för isolering av L-MSC ^5, men har tyvärringen känd ortologer i andra arter ^6. Forskare har rapporterat en mängd olika isoleringsmetoder för isolering av L-MSC från antingen lungvävnad eller vätska. Dessa varierar från fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) baserade metoder selektering för CD31 ^– / CD45 ^– / CD90 ⁺ celler ^7, CD31 ^– / CD45 ^– / epitelial celladhesionsmolekyl (EpCAM) – / Sca-1 + -celler ^8, multidrogresistens transportör ATP-bindande kassett G (ABCG2) positiva celler ⁹ eller Hoechst 33342 färgämne efflux ^10, till plast vidhäftning ^11,12 och migration av malet vävnad ^13.

Fördelarna med den häri presenterade förfarandet är flerfaldigt. Genom att använda en mild enzymatisk spjälkning och densitetsgradient ^14, erhåller man alla celler i densitetsintervallet som inkluderar MSCs men utesluter epitelceller eller endotelceller. Den efterföljande plast vidhäftning steg säkerställer att endast mesenchymal celler vidhäftar och bo i kultur, vilket eliminerar leukocyter. Viktigast dock tillåter CD146 ⁺ val steg för eliminering av fibroblaster, eftersom dessa celler inte uttrycker CD146. Expression av celladhesionsmolekylen CD146 är positivt korrelerad med multipotens, och är därför en bra markör för att sålla ut fibroblaster från en mesenkymal cellpopulation ^15-19. Detta är en fördel jämfört med användning av CD90 som en selektionsmarkör, eftersom det inte är bara uttrycks i MSC: er utan också i lipofibroblasts ^5,20. I detta protokoll har vi uttryckligen valt en magnetisk pärla urval, eftersom det är skonsammare på cellerna, och hela proceduren kan ske under sterila förhållanden. En annan viktig fördel med denna isoleringsförfarandet i motsats till utväxt metoden, är att det är relativt snabbt, 6-10 dagar i motsats till en månad eller mer för utväxt metoden. Tre till fem dagar efter den första isoleringen av mesenkymala befolkningen är redo för CD146 ⁺ sele ction; efter ytterligare tre till fem dagar de CD146 ⁺ cellerna är redo att användas för försöken eller kan frysas för senare användning. Den minskade tiden för kultur förbättrar kvaliteten på celler som MSCs transdifferentiera mot fibroblaster i förlängd ex vivo kultur ^19. Slutligen, på grund av den typ av protokoll är det möjligt att tillämpa denna metod på andra arter genom att helt enkelt välja lämpliga antikroppar, eller till och med till andra organsystem genom att justera valet av matsmältningsenzymer och inkubationstiden.

En detaljerat protokoll av denna isolering metod ges nedan och en schematisk översikt av isolering och efterföljande selektion av CD146 ⁺ subpopulation ges i figur 1A och 1B respektive. Dessutom är uppgifter ingår för passage, frysning och upptining dessa celler.

ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk översikt av isolering av lung mesenkymala celler (A) och efterföljande CD146 ⁺ cellval (B) min = minuter.; EDTA = etylendiamintetraättiksyra; 2 ^nd Ab = sekundär antikropp; a-CD146 Ab = primär anti-CD146-antikropp; ve celler = CD146 negativa celler; + ve celler = CD146 positiva celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av Animal Care kommittén vid universitetet i Ottawa (djuretik protokoll Ohří-1696). Djurvård utfördes i enlighet med institutionens riktlinjer. 1. Isolering av Lung mesenkymala stromaceller celler Förbered enzymblandningen i en 50 ml tub: väga in 30 U neutralt proteas, 2500 U kollagenas I och 500 U DNAse I. Dessa belopp räcker för lungorna hos en vuxen mus eller råtta valp. Förbereda på dag av isolering och förvara vid 4 ° C fram till anv…

Representative Results

Två av de mest pålitliga fysiska egenskaperna hos MSC, densitet och plast vidhäftning, används i den första delen av detta protokoll för att erhålla mesenkymala cellfraktionen i lungan som innehåller L-MSC. Även om densitetsgradient inter inkluderar monocyter och makrofager förutom lunga mesenkymala celler, plast vidhäftning följt av 3-5 dagars odling säkerställer att endast de lung mesenkymala celler kvar. I själva verket denna cellpopulation uttrycker den klassiska MSC y…

Discussion

Den isolering och odling av primär L-MSC innebär en möjlighet att bättre förstå deras funktion och deras interaktion med andra cellpopulationer på cellnivå, och deras roll i lungutveckling, hälsa och sjukdom. Detta är särskilt viktigt eftersom det saknas en specifik enskild markör för dessa celler gör det nästan omöjligt att studera dessa celler in situ. Som med alla primära cellpopulationer, bör man ha i åtanke att dessa celler är mer benägna att ändra sin karaktär ju längre de hålls i…

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC