该CRISPR / Cas9系统提供作出有针对性的基因组编辑获得和负担得起科学界的潜力。该协议旨在演示如何创建病毒将基因敲除使用CRISPR / Cas9系统感兴趣的基因,然后立体定位将它们注入成年小鼠大脑。
Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism’s genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.
学习正常生理和疾病病理的基础上,有必要精确地操纵在模式生物的基因表达。用于哺乳动物的模式生物,这在很大程度上是在建立和转基因小鼠的发展,其中感兴趣的遗传元件是由重组酶识别位点两侧的中心。这会导致这些侧翼的基因的位点特异性操纵。虽然这是一个成功的策略,这是时间和资源密集型;例如,创建一个三转基因动物,将表达基因两侧装接loxP,Cre重组酶和酶Cre报告基因需要多次交配和验证。相反,复制的立体定位注射编码荧光蛋白和重组到两侧装接loxP基因动物缺陷病毒颗粒不需要复杂的基因分型或育种策略1。另外,如果荧光蛋白和Cre表达病毒是共注射与第二病毒ENCO鼎不同的荧光蛋白,那么这提供了一个内部组织控制目标遗传操作。虽然这个策略仍然需要使用敲入动物,病毒介导的基于RNA的策略规避转基因动物的需要。例如,编码荧光蛋白和短发夹RNA(shRNA)的复制缺陷型病毒立体定向注射可以使用细胞的内源RNAi机制导致一种有效减少所关注的基因的转录物。然而,shRNA的策略产生微妙的基因敲除的下调通常会导致适度的细胞表型2。而击倒可能更生理学相关的杂合基因功能障碍,其降低的鲁棒性相比,敲除是不理想的新基因的表型的发现。
第三种技术是最近出现的CRISPR(聚集定期相互间隔短回文重复)/ Cas9(CRISPR相关蛋白9)系统,依靠这两个小外源RNA和DNA的切割酶的表达。的CRISPR / Cas9系统适于从该演进识别外国,侵入从病毒DNA和经由Cas9酶3,4-定位使其降解的方法,该原核免疫系统。这种强大的基因组编辑技术可用于创建有针对性的缺失,插入和突变;和下面的协议将概述如何使缺失感兴趣的基因以敲除其在体内的表达。该Cas9酶必须以引导RNA的同源感兴趣区域和邻接的支架的RNA来表达。使用这种技术的基因的敲除需要使用合成导的RNA(因组)在基因组中靶向Cas9到特定的区域,并诱导在感兴趣的位点双链断裂(DSB的)。这些双链断裂然后由内源性细胞修复机制通过非同源末端连接(NHEJ)的文件修复广告可能产生错义或无义突变,因此可以创建功能蛋白表达5的损失插入缺失。因为这个系统产生的基因组的改变,只需要在Cas9和因组的瞬时表达。然而,希望有一个稳定的荧光指示剂,以确定在这样的方式操作的细胞和它们的后代。
Lenti-和逆转录病毒具有稳定地整合目的DNA在其中保持长期的表达和有丝分裂过程中下降传递到子代细胞的宿主细胞的优势。这个协议描述了设计和生产两种类型的复制缺陷型,高滴度逆转录病毒的:人类免疫缺陷病毒衍生的慢病毒颗粒(慢病毒)和基于鼠马洛尼白血病病毒(反转录病毒)。尽管这两种病毒是能够支持大的转基因的稳定表达,反转录病毒颗粒可以仅整合入基因组杜与核膜的降解,和因此环细胞分裂可以用作标记的工具和出生日期的细胞6。尽管慢病毒有是相对低滴度7,这种方法,包括病毒收集期间使用咖啡因8的名声,通常会产生10 9和10 10颗粒/ ml的滴度。 lenti-和逆转录病毒的另一个优点是对于非常大的插入的公差。协议的下列集合概述设计伦蒂或逆转录病毒编码荧光记者,sgRNAs和Cas9地利用CRISPR / Cas9系统修改DNA以及表达荧光蛋白的过程。
小鼠立体定位神经外科是用于体内注射病毒研究形态学,功能和感染的神经元的连接性的有价值的方法。神经细胞病毒感染可反复使用的添长时间操纵表达水平即,如在整个开发和表达可通过使用各种不同的药物可诱导系统和特定的Cre驱动的表达的精确控制。这种特定的协议说明如何注入表达一种因组和Cas9敲除目标基因在成年小鼠脑中的病毒。小鼠恢复很快从病毒转基因的这个过程,表达可注射后48小时之内可见。然而,荧光表达出现了3个星期感染后,增加了产生接近最大水平星期的课程。该病毒进行注射立体小鼠可用于行为,电生理学或形态学研究。总体而言,这些程序的目的是展示如何敲除使用立体定位手术并表达特定因组和Cas9病毒在成年小鼠大脑的基因。
但是也有一些成功的病毒包装重要的几个关键步骤。细胞的健康至关重要之前和转染期间,为不健康细胞会大大降低病毒的产生量。如果转染和包装是成功的,然后将细胞的100%应该表达的荧光团和细胞应形成功能合胞体。在步骤3.2.4,轻敲管是必要的高滴度的转染效率,以及在HEPES缓冲的盐水的pH值必须准确。产生所需的病毒包装质粒的马克西棉片必须非常纯净。到这一点,是有帮助的乙醇沉淀DNA终的洗脱和在Tris-EDTA缓冲液重新悬浮。这也是非常重要的血清的量减少到2%或更少,所述咖啡因被添加到对病毒采集前6天(步骤3.4)的介质。如果血清不降低,那么最终纯化病毒包含血清PROT的不希望的量EIN。利用聚乙二醇沉淀病毒颗粒时6000的排除超速离心的必要性。同样重要的是要注意,Cas9含有CRISPR病毒通常具有约10滴度倍比单独含有荧光团病毒少。
对于立体定向手术,使用吸入麻醉允许快速和精确的控制或动物的意识相比,注射麻醉剂和麻醉可以在更大的年龄范围。它是保持外科手术器械的清洁和无菌非常重要,并且可再现的定位需要头的精确定位。确保没有在立体定位仪和头骨牢牢握在地方头部的俯仰或滚动。它可以是有用的,以允许颅骨中以便找到缝线来确定立体坐标干燥。此外,对于各立体坐标的速率和体积应根据经验确定。
这种技术限制,相对于腺相关病毒(自动增值服务)。因此当一个lenti-或反转录病毒的传播受到限制,尤其是,这些病毒感染的离散大脑区域时是有价值的,但不是对整体感染自动增值服务相关联用于动物行为分析。在这个协议中使用咖啡因的大大增加这些病毒的滴度,但它们仍然不那样高的AAV包装达到的效价。此外,稳定整合只有荧光团表达的优点,如CRISPR / Cas9形成甚至稳定的基因组编辑时,瞬时转染的和可能的是持续的Cas9和因组的表达可能最终产生脱靶效应。瞬时表达的CRISPR / Cas9系统自动增值服务足以产生在整个细胞分裂繁殖的基因组的改变,但是,荧光团表达不会被维持。
LEN创作抗-IGF和利用CRISPR / Cas9系统逆转录病毒将赋予针对任何新的基因在多种生物体的能力。基因编辑效率似乎依赖于导的RNA靶向Cas9裂解的序列。经验已经确定,%和克隆的80%至10包含插入缺失后测序感染Neuro2A细胞。它是目前未知的Neuro2A细胞计算插入缺失的频率是否反映那些神经元。指导的RNA等设计软件Benchling现在包括一个“上的目标”得分可能能够预测给定靶序列的效率。到什么程度,例如“关于目标”分数是可靠的需求中的神经元和其他细胞类型作为CRISPR-Cas9系统根据经验确定变得更加广泛实施。
基于慢病毒的转基因动物生产已经成功可变处理报表的慢病毒载体转基因交付SI成为lenced 11的DNA CRISPR介导的基因编辑可通过种系传递产生整个动物模型。因此,稳定的基因组编辑可以是尽管病毒递送的荧光团和Cas9转基因的沉默可以实现的。这可用于靶向基因组改变提供一种有效的平台。在病毒递送的CRISPR / Cas9系统,同时不需要的转基因生物,是这些技术的补充。例如,注射这种病毒颗粒成化合物转基因动物诱导性地表达的Cre和Cre的依赖性opto-或化学 – 基因的转基因应促进复杂的研究成遗传操作和神经元活性之间的关系。第二个例子是将这些Cas9 /因组病毒颗粒递送到一个条件性敲除,企图以筛选基因 – 基因相互作用。最后,这项研究的另一个令人兴奋的途径是患者的细胞表型与治疗化合物的筛选,从而可以用于验证和发现,在各种疾病打乱基因网络。
The authors have nothing to disclose.
由宁授予R01MH097949的自闭症试点补助7359到BWL和诺里斯棉花癌症中心光学成像仪器共享格兰特P30CA023108这项工作的支持和。
List of Cell Culture Reagents | |||
293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine solution, 100X (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
Polystyrene 10cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-053-CI |
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Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
List of Transfection Reagents | |||
5ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | S369-500 | |
(Na2HPO4) | |||
2X HEPES Buffered Saline (HBS) | 500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
filter and store at 4°C | |||
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
60CC L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
10ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
Stereotaxic Surgery Reagents | |||
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
Isoflurane | |||
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
MONOJECT® Needles Soft Pack 25g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 |