Den CRISPR / Cas9 systemet gir potensial til å gjøre målrettet genom redigering tilgjengelig og rimelig til det vitenskapelige samfunn. Denne protokollen er ment å demonstrere hvordan å lage virus som vil knockout et gen av interesse å bruke CRISPR / Cas9 system, og deretter injisere dem stereotaksikalt i den voksne mus hjernen.
Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism’s genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.
For å studere grunnlag av normal fysiologi og sykdom patologi, er det et behov for å manipulere nøyaktig genekspresjon i modellorganismer. For pattedyrmodellorganismer, er dette i stor grad sentrert på etablering og utvikling av transgene mus, hvor en genetisk element av interesse er flankert av nettsider anerkjent av en rekombinase. Dette kan resultere i et område bestemt manipulering av disse flankert gener. Selv om dette har vært en vellykket strategi, er det på tide og ressurskrevende; for eksempel å lage en trippel transgene dyr som ville uttrykke en floxed genet, Cre recombinase, og en Cre reporter gen krever flere parringer og validering. I motsetning til dette stereotaksisk injeksjon av replikasjon defekte virale partikler som koder for et fluorescent protein og rekombinasen inn i en floxed gen dyr ikke krever komplisert genotyping eller avl strategier 1. Videre, hvis en fluorescerende protein og Cre uttrykker viruset er co-injisert med en andre virus encoding en annen fluorescerende protein, da dette gir en innen-vev kontroll for målrettet genetisk manipulasjon. Selv om denne strategien fortsatt krever bruk av knock-i dyr, viralt medierte RNA baserte strategier omgå behovet for transgene dyr. For eksempel kan stereotaksisk injeksjon av replikasjonsdefekt virus som koder for en fluorescerende protein og en kort hårnål RNA (shRNA) bruke cellens endogene RNAi maskineri for å resultere i en kraftig reduksjon av transkripsjon av et gen av interesse. Men shRNA strategier produsere subtile genet knock-downs ofte resulterer i beskjedne cellulære fenotyper 2. Mens en knock-down kan være mer fysiologisk relevant for heterozygot gen dysfunksjon, sin redusert robusthet i forhold til en knock-out er ikke ideelt for fenotypiske oppdagelse av nye gener.
En tredje teknikk som nylig har dukket opp, den CRISPR (Gruppert regelmessig interspaced Kort palindromic Repeat) / Cas9 (CRISPR-forbundetprotein 9) system, er avhengig av ekspresjon av både en liten eksogene RNA og DNA skjære enzym. Den CRISPR / Cas9 systemet ble tilpasset fra prokaryote immunsystem som utviklet en metode for å identifisere fremmede, invaderende DNA fra virus og målretting det for nedbrytning via Cas9 enzymet 3,4. Denne kraftige genom redigering teknikken kan brukes for å lage målrettede slettinger innsett og mutasjoner; og følgende protokoll vil skissere hvordan å lage slettinger i et gen av interesse for å knockout sitt uttrykk in vivo. Den Cas9 enzym skal oppgis med en guide RNA homolog til regionen av interesse og sammenhengende med et stillas RNA. Knockout av et gen ved hjelp av denne teknikken krever målretting Cas9 til en bestemt region i genomet bruke syntetiske guide RNA (sgRNA), og indusere doble strandet pauser (DSB sin) på et område av interesse. Disse DSB sin blir deretter reparert av den endogene celle-reparasjon maskiner via ikke-homologe end-sammenføyning (NHEJ) som leannonse til indels som kan gi missense eller nonsense mutasjoner, og kan derfor skape et tap av funksjonell protein uttrykk fem. Fordi dette system frembringer genomiske forandringer, det bare krever den forbigående ekspresjon av de Cas9 og sgRNA. Det er imidlertid ønskelig for en stabil fluorescerende indikator for å identifisere celler og deres avkom manipuleres på denne måten.
Lenti- og retrovirus har fordelen av stabilt å integrere DNA av interesse inn i vertceller som opprettholder langvarig ekspresjon og er gått ned til dattercellene i løpet av mitose. Denne protokollen beskriver konstruksjon og produksjon av to typer replikasjonsdefektivt, høy titer retrovirus: humant immunsviktvirus avledet lentivirale partikler (lentivirus) og de som er basert på murine Maloney leukemi virus (retrovirus). Selv om begge disse virusene er i stand til å støtte stabilt uttrykker store transgener, kan retroviruspartikler kun integreres i genomet during celledeling med nedbrytning av kjernefysiske konvolutten, og kan derfor brukes som et verktøy til å merke og fødselsdato celler 6. Mens lentiviruses har et rykte for å være forholdsvis lav titer 7, denne metoden, herunder bruk av koffein 8 i løpet av viral samling, produserer rutinemessig titer av 10 9 og 10 10 partikler / ml. En annen fordel med lenti- og retrovirus er den toleranse for meget store innsatser. Følgende samling av protokoller skisserer fremgangsmåten for å utforme en lenti eller retrovirus som koder et fluorescerende reporter, sgRNAs, og Cas9 å utnytte CRISPR / Cas9 system for å modifisere DNA, så vel som uttrykker et fluorescerende protein.
Mouse stereotaxic nevrokirurgi er en verdifull metode for å injisere virus in vivo for å studere morfologi, funksjon og tilkobling av infiserte nerveceller. Virusinfeksjon i neuronene kan anvendes for å manipulere uttrykk nivåer over en lengre periode av time, som for eksempel gjennom utvikling, og ekspresjon kan kontrolleres nøyaktig ved anvendelse av forskjellige legemiddel induserbare systemer og spesifikke Cre drevet ekspresjon. Dette bestemte protokollen forklarer hvordan du injiserer et virus som uttrykker en sgRNA og Cas9 til knockout et gen av interesse i hjernen til en voksen mus. Mus komme seg meget raskt fra denne fremgangsmåten og ekspresjon av den virale transgenet kan ses i løpet av 48 timer etter injeksjon. Imidlertid synes fluorofor uttrykk til å øke i løpet av uker resulterer i tilnærmet maksimal nivåer ved 3 uker etter infeksjon. Mus som gjennomgår viral stereotaksisk injeksjon kan brukes til oppførsel, elektrofysiologi, eller morfologiske studier. Totalt sett er hensikten med disse prosedyrene for å demonstrere hvordan man knockout et gen i den voksne mus hjernen ved hjelp av stereotaktisk kirurgi og et virus som uttrykker en bestemt sgRNA og Cas9.
Det er noen viktige skritt som er viktig for vellykket viral emballasje. Celle helse er kritisk før og under transfeksjon, som usunn celler vil i stor grad redusere mengden av viruset produsert. Dersom transfeksjon og emballasjen er vellykket, deretter 100% av cellene skal uttrykke fluoroforen og cellene bør danne en funksjonell syncytium. I trinn 3.2.4, trykke røret er nødvendig for høy-titer transfeksjon effektivt, og pH-verdien i HEPES-bufret saltvann må være nøyaktig. Maxi-forbereder som produserer plasmidene nødvendige for viral emballasje må være ekstremt rent. Til dette punkt er det nyttig å etanol utfelle det endelige DNA-eluering og gjensuspendere i Tris-EDTA buffer. Det er også svært viktig for å redusere mengden av serum til 2% eller mindre i media som koffein blir lagt til på dag 6 (trinn 3.4) før virussamling. Hvis serumet ikke reduseres, da den endelige rensede viruset vil inneholde en uønsket mengde av serum protein. Anvendelsen av polyetylenglykol 6000 ved utfelling av viruspartikler utelukker nødvendigheten av ultrasentrifugering. Det er også viktig å merke seg at Cas9 CRISPR inneholdende virus har typisk en titer rundt 10 ganger mindre enn virus utelukkende inneholdende en fluorofor.
For stereotaksisk kirurgi, bruk av inhalert anestesi tillater hurtig og nøyaktig kontroll eller dyrets bevissthet i forhold til injiserbare bedøvelsesmidler og lar anestesi over et større aldersgruppe. Det er svært viktig å holde den kirurgiske instrumenter rene og sterile, og reproduserbar målretting krever nøyaktig posisjonering av hodet. Pass på at det ikke er pitching eller rulling av hodet i stereoinstrument og at hodeskallen føles godt på plass. Det kan være nyttig å la skallen for å tørke for å finne suturene for å bestemme de stereotaksiske koordinater. I tillegg bør hastigheten og volumet for hver stereotaksisk koordinat bestemmes empirisk.
Denne teknikken er begrensende ved at spredningen av et lenti- eller retrovirus er begrenset, spesielt når sammenlignet med adeno-assosiert virus (AAVs) .Derfor, disse virusene er verdifulle når det infiserer en diskret hjerneregion, men ikke for generelle infeksjoner assosiert med AAVs anvendes for adferdsanalysen i dyr. Bruken av koffein i denne protokollen i stor grad øker titer av disse virusene, men de er fortsatt ikke så høy som de titere oppnådd i AAV emballasje. Dessuten er stabil integrering bare en fordel ved fluorofor uttrykk, som CRISPR / Cas9 danner stabile genomiske endringer, selv når transient transfektert, og det er mulig at pågående ekspresjon av Cas9 og sgRNA kan til slutt frem av mål-effekter. Den forbigående uttrykket CRISPR / Cas9 system med AAVs er tilstrekkelig til å produsere genomisk endringer som forplanter seg gjennom celledelinger, men fluorophore uttrykk vil ikke bli opprettholdt.
Opprettelse av lenTI og retrovirus som anvender CRISPR / Cas9 system vil gi muligheten til å målrette en hvilken som helst ny gen i en rekke forskjellige organismer. Effektiviteten av genet redigering ser ut til å være avhengig av sekvensen av guiden RNA rettet mot Cas9 cleavage. Det er blitt fastslått empirisk at mellom 10% og 80% av klonene inneholder indels etter sekvense infisert Neuro2A celler. Det er for øyeblikket ukjent om Indel frekvenser beregnet i Neuro2A cellene er reflekterende av de i nerveceller. Guide RNA design software som Benchling inkluderer nå en "on-target" poengsum som kan være i stand til å forutsi effektiviteten av et gitt mål sekvens. I hvilken grad slike "on-target" score er pålitelige behov for å bli empirisk bestemt i nevroner og andre celletyper som CRISPR-Cas9 system blir mer allment implementert.
Lentivirus-basert transgene dyr produksjon har vært variabelt vellykket med rapporter om at lentivirus levert transgener bli silenced 11. CRISPR mediert gen redigering av DNA kan bli ført gjennom kjønnsceller for å generere hele dyremodeller. Dermed kan stabil genomisk redigering være oppnåelig tross taushet av virus levert fluorophores og Cas9 transgener. Dette kan gi en effektiv plattform for målrettet genomiske forandringer. Det virale levering av CRISPR / Cas9 system, samtidig som det ikke krever transgene organismer, er komplementære til disse teknikker. For eksempel, injisere slike viruspartikler til en forbindelse transgene dyr som å indusere uttrykker Cre og Cre avhengig opto- eller chemo-genetiske transgener bør legge til rette for komplekse studier i forholdet mellom genetiske manipulasjoner og neuronal aktivitet. Et annet eksempel er å levere disse Cas9 / sgRNA virale partikler inn i en betinget knockout i et forsøk på å screene for gen-gen-interaksjoner. Til slutt, en annen spennende rute med denne forskningen er screening av fenotyper og terapeutiske forbindelser i pasient avledet celler, noe som kanbrukes til å validere og oppdage genetiske nettverk som er forstyrret i ulike sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Ninh gi R01MH097949 og Autism Speaks Pilot Grant 7359 til BWL og Norris Cotton Cancer Center Optical Imaging Delt Instrumentation Grant P30CA023108.
List of Cell Culture Reagents | |||
293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine solution, 100X (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
Polystyrene 10cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-053-CI |
|
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
List of Transfection Reagents | |||
5ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | S369-500 | |
(Na2HPO4) | |||
2X HEPES Buffered Saline (HBS) | 500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
filter and store at 4°C | |||
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
60CC L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
10ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
Stereotaxic Surgery Reagents | |||
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
Isoflurane | |||
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
MONOJECT® Needles Soft Pack 25g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 |