タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング
Summary
At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.
Abstract
生きた細胞内での動的なシグナル伝達イベントの可視化が課題でした。我々は、植物細胞内でのシグナル伝達の空間的な分布を監視するタンパク質 – タンパク質相互作用を試験から、タバコ表皮細胞における生体分子蛍光相補性（BIFC）アッセイを確立した一過性発現系を拡大しました。このプロトコルでは、我々は相互作用し、 シロイヌナズナ MAPKKK YODAとMAPK6との間のシグナリングは、原形質膜で起こることを示すためにBIFCアッセイを使用しました。足場タンパク質のBASLを共発現させた場合、YODA-MAPKの相互作用は、再分配と空間的にCFP-BASLとの共偏します。この修正されたタバコの発現システムは、ローカリゼーションおよび動的な変更（4日未満）と蛍光タンパク質の色（少なくとも3）の倍数に対応することができるシグナル伝達の迅速な検査を可能にします。我々はまた、タンパク質の分布（非対称の空間的局在性、または「分極」を定量化する詳細な方法を提示し;）タバコ細胞インチこの高度なタバコ発現系は、生植物細胞の動的シグナリング事象の迅速な試験のために広く使用される可能性を有しています。
Introduction
タンパク質は、予測不可能な細胞環境で発生するほぼすべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たして複雑な階層型ネットワークとフォーム複合体内で相互作用します。しかし、成長の応答に対する植物の開発から、だけですぐにも効率的に細胞内レベルでこれらのダイナミックシグナル伝達事象を認識し、モニターすることができない便利なツールの欠如がありました。
タバコ葉表皮における一過性タンパク質発現システムは、生細胞内で蛍光タンパク質を可視化するための利点を訴えています。このシステムは、翻訳後タンパク質修飾とタンパク質の局在の迅速な検査を可能にする半in vivoでの条件を提供します。補完YFP信号を検査することによって、二分子蛍光相補性（BIFC）アッセイは、植物細胞内でのタンパク質 – タンパク質相互作用の可能性を通知します。他の方法に比べて、 例えば、酵母2ハイブリッド（Y2H）と共同-immunoprecipitation（共同IP）、BIFCは、タンパク質 – タンパク質相互作用は、細胞内レベルで発生する可能性があるコンパートメントを可視化する強力な手段を提供します。
非対称細胞分裂（ACD）は、組織/器官の形成のための新たな細胞型の生成中に細胞集団を幹維持するので、真核多細胞を促進するために不可欠な機構である。 シロイヌナズナ気孔発生は、植物にACDを研究するためのモデルシステムとして用いられてきました。前駆細胞、メリステモイド母細胞は、二つの異なる娘細胞を生成するために非対称的に分割し、メリステモイドは（ガード細胞のペアに終了する前に、細胞様の分裂幹受ける）と気孔系統の地上セル（SLGC）は（分裂と分化することができます舗装細胞）、それぞれ（ 図1）。気孔ACDでは、気孔系統における非対称の新規タンパク質のブレイキング（BASL）は分割非対称性を駆動するためにpremitotically偏光されて、どの株式会社リュド物理的な非対称性および細胞運命非対称性1。 MAPKKK YODAとのMAPK、MPK3と6から成るMAPKカスケードは、気孔分割パターニングと運命の採用2,3、4,5のための中心です。
最近、Zhang ら 。 ACD 6気孔シロイヌナズナのYDA-MAPKシグナル伝達経路への極性タンパク質BASLをリンクされています。標準的なYODA-MAPK経路は、MPK3 / 6を通じて、BASLをリン酸化し、その偏光を活性化させます。足場としてリン酸化BASL機能やタンパク質複合体を形成し、細胞表層6でシグナリングを集中するYODA（YDA）とMPK3 / 6を募集しています。 MAPKコンポーネントとBASLとYDA-MAPK経路の間に正のフィードバックループの偏光は、植物細胞中のタンパク質の偏光のための新規メカニズムを表します。局所的に濃縮されたMAPKシグナル伝達は密接に気孔ACD 6（ 図1）における細胞運命の分化にリンクされると仮定されています。 kの一つこのモデルをサポートEY実験データがBASL 6の発現により誘導されたMAPKの空間的な再分配を実証したタバコアッセイから来ました。
MAPK分子は、しばしば、細胞の内部にどこでも発見されたため、MAPKシグナル伝達が起こる場合、一般的には、監視することは容易ではありません。本研究では、シグナリングリレーが発生する場所を示唆するために、上流キナーゼおよび下流のものとの間の相互作用を可視化するために、分割YFPシステムを利用しました。我々はさらに、どのように補完YFPが空間的に共同によって変調することができるかどうかを可視化する（タンパク質 – タンパク質相互作用を示唆する）、分割YFPペアと第3のタンパク質を（CFPタグ付き）を共発現することによりBIFCシステムの使用を拡張しましたCFPタンパク質を発現しました。そうすることによって、我々はタバコ表皮の細胞表層で偏パターニングに均一な分布からYDAとMPK6、間の相互作用の空間的な再編成を誘導されたCFP-BASLの共発現を示しましたら細胞。このシステムは、したがって、細胞は、内部または外部刺激（ 例えば、他のタンパク質の同時発現、化学的応用、病原体攻撃または環境の変化などによりチャレンジされたときの条件の下で、植物細胞中で動的シグナル伝達事象を監視するために開発される可能性があります。 ）。
Protocol
Representative Results
Discussion
一般的な使用およびシグナル伝達のためのタバコ一過性発現系の可能な修正：蛍光タンパク質の過剰発現（FP）が正常に植物細胞内でタンパク質の細胞内局在の高速検査に使用されてきたタバコの表皮中のタンパク質をタグ付き。しかし、 植物体中のタンパク質複合体の動的シグナリング分布を研究することは、複雑な細胞内のコンテキスト、一過性のタンパク質-タンパ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.
Materials
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25x75mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24×50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40 x objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO , NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
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