Myéloïde cellule d&#39;isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoïtes

Résumé

Nous décrivons ici un protocole permettant d’isoler les cellules myéloïdes de la peau de souris et de drainer les ganglions lymphatiques après injection intradermique de sporozoïtes de Plasmodium. La cytométrie en flux des cellules collectées fournit un test fiable pour caractériser la réponse inflammatoire de la peau et des ganglions lymphatiques drainants au parasite.

Résumé

L' infection du paludisme commence lorsque le stade sporozoïte de Plasmodium est inoculé dans la peau d'un hôte mammifère par une piqûre de moustique. Le parasite très mobiles non seulement atteint le foie pour envahir les hépatocytes et de transformer en une forme globulaire-infectieux. Il migre aussi dans la peau et les ganglions lymphatiques drainant le site proximal par injection, où il peut être reconnu et dégradé par des résidents et / ou des cellules myéloïdes recrutés. Imagerie intravitale a rapporté le recrutement précoce de leucocytes positifs fluorescent brillamment Lys-GFP dans la peau et les interactions entre les sporozoïtes et CD11c ⁺ cellules du ganglion lymphatique de drainage. Nous présentons ici une procédure efficace pour récupérer, identifier et dénombrer les sous-ensembles de cellules myéloïdes qui sont recrutés sur la peau de souris et de drainage des ganglions lymphatiques après l'injection intradermique de immunisant doses de sporozoïtes dans un modèle murin. La caractérisation phénotypique utilisant flux multi-paramétrique fournit cytométrieun test fiable pour évaluer les changements cellulaires dynamiques précoces en réponse inflammatoire à l' infection par Plasmodium.

Introduction

Le paludisme est l'une des maladies infectieuses les plus meurtrières dans le monde, tuant plus d'un demi-million de personnes par an. L' infection par Plasmodium, l'agent causal de la maladie, débute par une phase de pré-érythrocytaire (PE). Au cours de cette phase, les sporozoïtes injectés dans la peau de l' hôte par un moustique anophèle femelle atteignent le foie via la circulation sanguine et de se différencier hépatocytes à l' intérieur dans les formes parasitaires qui infectent les globules rouges et causent les symptômes de la maladie.

Les étapes de PE de Plasmodium représentent u....

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de l'Institut Pasteur et par le Comité local d'éthique sur l'expérimentation animale (comité éthique IDF-Paris 1, Paris, France; numéro de contrat: 2.012 à 0.015) et réalisées en conformité avec les directives et règlements applicables.

1. Matériaux et réactifs

1. Utilisez femelle moustiques Anopheles stephensi (souche Sda500) qui se nourrissent de souris infectées 3-5 jours après la levée et à l' arrière , comme décrit précédemment ^21.
2. Utiliser des parasites Plasmodium berghei ANKA clone exprimant le gène de la protéine fluorescente ver....

Résultats

Nous avons récemment démontré que l' injection seringue-aiguille doses immunisantes de P. berghei sporozoïtes dans la peau de la souris induit un recrutement successif de polynucléaires neutrophiles suivie par les monocytes inflammatoires de la peau et dLn ^19. La section protocole décrit ci - dessus détaille la procédure utilisée pour isoler avec succès des cellules myéloïdes en direct à partir des deux tissus après des injections multiples d' un grand nombre .......

Discussion

Dans la perspective de la vaccination à grande échelle de l' homme à l' aide d' un vaccin sporozoïtes du paludisme ensemble, l' un des principaux défis à relever est de développer des voies et des méthodes d'administration des parasites optimisés pour assurer la vaccination et la protection ^24,25 réussie. Chez les humains, l'évaluation de l' efficacité protectrice médiée par des parasites vivants atténués (LAP) a été réalisé en suivant les moustiques naturel morsures ^2, .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kétamine : Imalgene® ; 1 000	Merial-50		mg/kg : injection préalable de sporozoïte 125 mg/kg : sacrifice préalable
Xylazine : Rompun® ; 2 %	Bayer-5		mg/kg : injection préalable de sporozoïte 12,5 mg/kg :
seringue NanoFil de sacrifice préalable + aiguille de calibre 35	World Precision Instruments.	-	-
Omnican® ; 50 Seringue à insuline 0,5 ml/50 U.I.	B. Braun Medical  ;
Plaque de culture tissulaire à 6 puits &ndash ; Fond plat	BD Falcon  ;		353046-70
et micro ; crépine à cellules M  ;	BD Falcon  ;	352350-2
ml seringue	Terumo	SS-02S-BLUE
MAXTM 15 ml Tube conique en polypropylène	BD Falcon  ;		352097-BLUE
MAXTM 50 ml Tube conique en polypropylène	BD Falcon  ;		352098-5
ml Tube en polystyrène à fond rond avec 35 µ ; m Capuchon de crépine	BD Falcon
1x CaCl2- et MgCl2--free	Life Technologies	14190-094-DMEM
1x + GlutaMAXTM	Life Technologies	31966-021-Collagénase
de Clostridium histolyticum, type IV 0,5-5,0 unités FALGPA/mg solide  ;	Sigma-Aldrich  ;	C5138	400 U/ml  ;
Désoxyribonucléase I du pancréas bovin, type IV  ;	Sigma-Aldrich  ;	D5025	50 et micro ; g/ml
de sel disodique EDTA	Sigma-Aldrich  ;	E-5134	10 mM ou 2,5 mM
FBS	Biowest	S1810-500-HEPES
solution tampon (1M)	Gibco	15630-056	25 mM
Trypan blue Stain (0,4 %)	Life Technologies	15250-061	Dilution 1:10  ;
Anti-souris CD16/CD32 (clone 2.4G2)	BD Biosciences	553142	10 µ ; g/ml final (1:50)
DAPI FluoroPureTM grade	Life Technologies	D21490	1 µ ; g/ml final
Anti-souris CD45 (clone 30-F11)	BD Biosciences	559864	; Dilution 1:200
Anti-souris CD11b (clone M1/70)	BD Biosciences	557657	; Dilution 1:400
Anti-souris CD8&alpha ; (clone 5H10)	Technologies de la vie	MCD0830	Dilution 1:100
Souris femelles C57BL/6JRj (âgées de 7 semaines)  ;	Laboratoires Janvier	-	-

9151125-MultiwellTM352235-DPBS