Упрощенный метод для сверхнизкой плотности, Долгосрочное Первичный гиппокампа Нейрон культуры
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
Культивирование первичных гиппокампа нейронов в пробирке облегчает механистической опрос многих аспектов развития нейронов. Разъединенные эмбриональные нейроны гиппокампа часто могут успешно расти на покровные стекла при высокой плотности при бессывороточной условиях, но культуры низкой плотности обычно требуют поставки трофических факторов путем совместного культивирования их с фидерной глии слоем, получение которого может занять много времени и трудоемкий. Кроме того, наличие глии может запутать интерпретацию результатов и исключает исследований по механизмам нейроноподобных специфичны. Здесь упрощенный метод представлен для ультра-низкой плотности (~ 2000 нейронов / см 2), долгосрочный (> 3 месяца) первичной гиппокампа нейрон культуры , который находится под бессывороточной условиях и без поддержки глии клеток. Нейроны низкой плотности выращены на поли-D-лизином покровные с покрытием, и переворачивается на нейроны с высокой плотностью, выращенных в 24-луночный планшет. Вместо того чтобы использовать парафиновые точки, чтобы создать пространство betweeп два нейрональных слоев, экспериментаторы могут просто травить пластический дно колодца, на котором нейроны высокой плотности проживают, чтобы создать Микрокосмом, способствующую росту нейронов низкой плотности. Сокультуры можно легко поддерживать в течение> 3-х месяцев без значительной потери нейронов низкой плотности, тем самым облегчая морфологические и физиологические исследования этих нейронов. Чтобы проиллюстрировать это успешное состояние культуры, данные предоставляются, чтобы показать образование обильное синапсов в клетках с низкой плотностью после длительной культуры. Эта система сокультуры также способствует выживанию редких отдельных нейронов, выращенных на островах поли-D-лизином субстратов и, таким образом, образованию autaptic соединений.
Introduction
Рост гиппокампа нейронов в условиях , в пробирке позволяет вести наблюдение и экспериментальные манипуляции этих нейронов, которые в противном случае не представляется возможным в естественных условиях. Этот экспериментальный подход широко используется для выявления нейронные механизмы роста, полярности, спецификации аксонов, торговлей и внутриклеточной локализации белков, формирование синапсов и функционального созревания 1. Эти в пробирке культивированный нейронов гиппокампа, когда собирали из поздних эмбриональных стадий, относительно чистый (> 90%) глутаматергические клетки пирамидальной морфологии 2. Поскольку нейроны выращивали в поверхности 2-D в условиях , в пробирке, этот метод позволяет легко наблюдать, например, живого изображения или иммуноцитохимию (ICC) окрашиванием через единый фокальной плоскости 3; или манипуляции, такие как медикаментозное лечение и трансфекциях 3-6. При выращивании при высокой плотности, нейроны, как правило, имеют высокие показатели выживаемости из-за более высокого сотрудничестваncentrations секретируемых факторов роста в дополнение к алиментарной поддержки со стороны средств массовой информации роста, а также из – за аксонов контакт-зависимые механизмы 7. Тем не менее, низкая плотность нейронов гиппокампа являются желательными для морфологических исследований, где отдельный нейрон может быть отображенных в полном объеме или окрашенными для анализа ICC. Нейроны низкой плотности трудно поддерживать в культуре из – за отсутствия поддержки паракринной и , таким образом , часто требуют трофической поддержки со стороны глиальных ( как правило , коркового астроцитов) фидерного слоя, который должен быть подготовлен до нейрон культуры 2. При культивировании совместно с глиальной фидерного слоя клеток, нейронов низкой плотности выращивают на покровных стеклах, а затем переворачивается на вершине глии слоя таким образом, что нейроны низкой плотности и глии обращены друг к другу. Небольшое ограниченное пространство между глии и нейронов создается путем размещения парафиновые точки на углах покровные, создавая тем самым «сэндвича» макет 2,8,9. Нейроны низкая плотность будет расти шithin ограниченного пространства между глии и покровного, что создает разрешительный микросреду с концентрированными факторами, выделяемыми нейронов и глии. Такой подход позволяет получить низкую плотность, полностью развитые нейроны, которые отстоят друг от друга достаточно, поэтому маркировку, облегчающую ICC или исследования живого изображения.
Очевидным недостатком нейрон-глиальных сокультивирования, помимо того, что отнимает много времени и трудоемким, является то, что он предотвращает исследование нейрон-специфический, или клеточно-автономными, механизмы. Хотя эта система является гораздо менее сложной , чем в естественных условиях нервной ткани, воздействие глии на развитие нейрон через секретируемых, пока еще не полностью определенных факторов могут посрамить эксперименты 10. Таким образом, в экспериментах, которые требуют изучения конкретных механизмов нейрон, определенные условия культивирования, которые удаляют сыворотку и глиальных слой подложки необходимы. Предыдущее исследование удалось культивировании низкие концентрации нейронов (~ 9000 клеток / см 2) , используя юРЗЭ мерная матрица гидрогеля 11. Так как относительно чистый нейрональной популяции можно культивировать при высокой плотности при бессывороточной условиях без глии, мы предполагаем, что сверхнизкой плотности нейронов гиппокампа можно выращивать в не содержащей сыворотки определяется культуральной среды путем совместного культивирования их с нейронами с высокой плотностью, в путь, который является аналогом традиционно принятой нейрон-глии сокультивирования. Действительно, высокая плотность гиппокампа нейрон культур в конфигурации «сэндвича» были недавно использованы для поддержки небольшого количества специализированных КРУПНОКЛЕТОЧНЫХ эндокринных нейронов 12.
Таким образом, совместное культивирование с нейронами высокой плотности может позволить нейроны с низкой плотностью, чтобы получить коэффициенты трофической поддержки, которая достаточна для того, чтобы на долгосрочное выживание. Этот протокол нейронов культивирования сверхнизкой плотности, таким образом, сформулирована и утверждена. Протокол может быть реализован в одном эксперименте, подготовив высокой плотности (~ 250000 клеток / мл) ЦСИsociated нейроны гиппокампа, а затем сделать разбавление , чтобы получить плотность ~ 10000 нейронов / мл (~ 3000 нейронов / покровное, или ~ 2000 нейронов / см 2), что значительно ниже , чем у большинства сообщалось культур низкой плотности 2,3,9 , 11,13. Это состояние культуры свободно упоминается как культура "ультра-низкой плотности" и используется с "низкой плотности" интер-непостоянно. Нейроны высокой плотности высевают на поли-D-лизин покрытием 24-луночных планшетах; в то время как нейроны с низкой плотностью высевают на поли-D-лизин покрытием покровные стекла 12 мм, которые размещены внутри другой 24-луночный планшет. Покровные с соблюдением нейронами низкой плотности перевернуты на вершине нейронов высокой плотности 2 ч спустя после того, как нейроны происходят и прикреплены к покровные. Кроме того, вместо того чтобы использовать парафиновые точки, чтобы поднять покровные над нейрон слоя высокой плотности, шприц иглой 18 G использовали травление в нижней части 24-луночные планшеты с двумя параллельными полосами. Полученный DisplACED, примыкающие пластмассы обеспечивают повышенную поддержку покровные стекла. Это пространство последовательно измеряется при 150-200 мкм, что позволяет достаточно кислорода и культуральной среды, обеспечивая при этом обмен микросреду с концентрированными трофических факторов. При выполнении этого условия, нейроны низкая плотность растут интенсивно, и может выжить после трех месяцев в культуре. Когда эти нейроны трансфицировали плазмидой GFP через три недели в культуре, дендриты обильно усеяна дендритных шипиков. В качестве доказательства принципа, приведены данные, чтобы показать, что эта система совместно культуры поддерживает сверхнизкие культур плотности нейронов гиппокампа, посеянных на поли-D-лизином 'микро-островков », где нейроны образуют autaptic соединения, которые могут облегчить исследование клетки -autonomous, сетевые независимые механизмы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем подробный протокол для долгосрочной культуры ультра-низкой плотности нейронов гиппокампа глутаматэргических под бессывороточной условиях. В ~ 2000 нейронов / см 2, плотность по меньшей мере , в два раза ниже , чем у большинства препаратов "низкой плотности" куль…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
