Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em> Xenopus</em> Kidney
Summary
Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.
Abstract
De embryonale nier van Xenopus laevis (kikker), de pronephros bestaat uit een nefron en kan worden gebruikt als model voor nierziekte. Xenopus embryo's groot extern ontwikkelen, en kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door micro-injectie of chirurgische procedures. Daarnaast zijn lot kaarten vastgesteld voor vroege embryonale ontwikkeling. Gerichte micro-injectie in individuele blastomere die uiteindelijk leiden tot een orgaan of weefsel van belang geven kan worden gebruikt om selectief overexpressie of neerslaan van genexpressie in deze beperkte regio afneemt neveneffecten in de rest van de ontwikkelende embryo. In dit protocol beschrijven we hoe u gebruik maken van gevestigde Xenopus lot toegewezen aan de ontwikkeling van Xenopus nier (de pronephros), door middel van micro-injectie te richten op specifieke blastomeren van 4- en 8-cellige embryo. Injectie van lineage tracers maakt verificatie van de specifieke targeting van de injectie.Na embryo's ontwikkeld stadium 38-40, whole-mount immunokleuring gebruikt om pronephric ontwikkeling visualiseren, en de bijdrage van doelcellen om het pronephros kan worden beoordeeld. Dezelfde techniek kan worden aangepast aan targeten andere weefseltypen naast de pronephros.
Introduction
De Xenopus embryonale nier, de pronephros, is een goed model voor het bestuderen nier ontwikkeling en ziekte. De embryo's ontwikkelen extern, zijn groot, kan worden geproduceerd in grote aantallen, en zijn gemakkelijk te manipuleren door middel van micro-injectie of chirurgische procedures. Bovendien worden de betreffende genen nierontwikkeling in zoogdieren en amfibieën geconserveerd. Zoogdieren nieren verder komt in drie fasen: de pronephros, mesonephros en metanefros 1, terwijl embryonale amfibieën hebben een pronephros en volwassen amfibieën hebben een metanefros. De basis filtering eenheid van deze nier vormen is het nefron, en beide zoogdieren en amfibieën vereisen dezelfde signaling cascades en inductieve evenementen om nefrogenese 2, 3 ondergaan. De Xenopus pronephros bevat één nefron bestaat uit proximale, tussengelegen, distale en buisjes verbinden, en een glomus (analoog aan het zoogdier glomerulus) 1, 4-6 (figuur 1 </strong>). De enkele, grote nefron in de Xenopus pronephros maakt het geschikt als een eenvoudig model voor de studie van genen betrokken bij nier- ontwikkeling en ziekteprocessen.
Lot van de cel kaarten zijn vastgesteld voor de vroege Xenopus embryo's, en zijn vrij bij Xenbase 11/7 online beschikbaar. We beschrijven een techniek voor micro-injectie van lineage tracers voor de ontwikkeling Xenopus pronephros gericht, hoewel dezelfde techniek kan worden aangepast aan andere weefsels zoals het hart of ogen targeten. Lineage tracers zijn labels (zoals vitale kleurstoffen, fluorescent gelabelde dextranen, histochemisch detecteerbare enzymen en mRNA coderend fluorescerende eiwitten) die kan worden geïnjecteerd in een vroeg blastomeer, waardoor de visualisatie van de nakomelingen van die cel tijdens de ontwikkeling. Dit protocol maakt gebruik van MEM-RFP mRNA coderend membraan gerichte rood fluorescerend eiwit 12, een lijn tracer. De beoogde micro-injectie technieken voor individuele blastomeren in de 4- en 8-cellige embryo beschreven kunnen worden gebruikt voor injectie met morpholinos te breken genexpressie, of exogene RNA een gen van belang tot overexpressie. Door injecteren in de ventrale, vegetale blastomeer, vooral de pronephros van het embryo zal gericht, waardoor de contralaterale pronephros als ontwikkelings controle. Co-injectie van een tracer controleert of de juiste blastomere werd geïnjecteerd, en laat zien welke weefsels in het embryo is ontstaan uit de geïnjecteerde blastomere, het verifiëren van de gerichtheid van de pronephros. Immunokleuring van de pronephros maakt visualisatie van hoe goed de pronephric buisjes zijn gericht. Overexpressie en knockdown effecten kunnen dan worden gemaakt tegen de contralaterale zijde van het embryo, die als ontwikkelings- controle en kan worden gebruikt om de pronephric index 13 berekend. De beschikbaarheid die het lot maps toelaat gerichte micro-injectie technieken worden gebruikt om weefsels oth targetener dan pronephros en co-injectie van een fluorescente tracer kan de gerichte micro-injectie op elk weefsel vóór de analyse worden geverifieerd.
Tijdens embryo micro-injectie, dient ontwikkelings temperatuur strak gereguleerd, omdat de snelheid van Xenopus ontwikkeling sterk afhankelijk is 14. Embryo's worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (14-16 ° C) voor de 4- en 8-cell injecties omdat de ontwikkeltijd wordt vertraagd. Bij 22 ° C, ontwikkeltijd uit stap 1 (1 cel) naar fase 3 (4 cellen) ongeveer 2 uur, terwijl bij 16 ° C ontwikkelingstijd naar fase 3 ongeveer 4 uur. Het duurt ongeveer 15 minuten om een 4-cel embryo een 8-cel (stap 4) embryo bij 22 ° C, maar duurt ongeveer 30 minuten bij 16 ° C. Evenzo, bij 22 ° C duurt slechts 30 minuten voor een 8-cellige embryo op weg naar een 16-cel embryo (stap 5). Ditmaal echter 45 minuten bij 16 ° C. Dewaardo or, is het nuttig om langzaam de ontwikkelingssnelheid van de embryo voldoende voor injecties in het 8-cellig stadium schakelen voordat de embryo's ontwikkelen tot het 16-cellig stadium. Bovendien kan groeitemperatuur gemoduleerd versnellen of vertragen van embryonale ontwikkeling tot de nier volledig is ontwikkeld.
De epidermis van kikkervisje stadium Xenopus embryo's is relatief transparant, zorgen voor gemakkelijke beeldvorming van de ontwikkelingslanden pronephros zonder dissectie of clearing van het weefsel 15. Door de relatieve transparantie van embryonale ontwikkeling, live cell imaging is ook mogelijk 16,17. Whole-mount immunokleuring aan de pronephros visualiseren is mogelijk met gevestigde antilichamen die de proximale, tussengelegen, distale en het aansluiten van buisjes van het podium 38 labelen – 40 embryo's die het mogelijk maken voor de beoordeling van pronephric ontwikkeling na gerichte manipulatie van genexpressie in Xenopus embryo's 18-20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gericht op de pronephros van het ontwikkelen van Xenopus embryo's baseert zich op het identificeren en het injecteren van de juiste blastomere. Injectie van de V2 blastomeer 8-cellige embryo richt zich op de linker pronephros 18. Dit laat de contralaterale rechter pronephros als een interne controle. Als morfolino knockdown of RNA overexpressie wordt gebruikt om nierontwikkeling veranderen, kan de contralaterale rechter pronephros worden gebruikt om de effecten van gen knockdown of overexpressie …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health subsidie NIDDK (K01DK092320) en het opstarten van de financiering van de afdeling Kindergeneeskunde aan de Universiteit van Texas McGovern Medical School.
Materials
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/mL | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27G monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 mL Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label distal tubule and duct. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label distal tubule and duct. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional – for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional – for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann’s Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms’ tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. , 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. , (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
