Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.
רוב המחקרים על morphogenesis להסתמך על תיאורים איכותיים על איך תכונות אנטומיות מושפעים השיבוש של גנים ספציפיים מסלולים גנטיים. תיאורים כמותיים לעתים רחוקות מבוצעים, למרות מניפולציות גנטיות מייצרות מגוון של תופעות פנוטיפי ווריאציות הם נצפו גם בקרב אנשים בתוך קבוצות ביקורת. מתעוררים הראיות עולה כי מורפולוגיה, גודל ומיקום של אברונים לשחק תפקיד מעריכים בעבר, זאת בסיסי בתפקוד הישרדות התא. כאן אנו מספקים צעד אחר צעד הוראות לביצוע ניתוחים כמותיים של פנוטיפים בצומת neuromuscular תסיסנית הזחל (NMJ). אנו משתמשים כמה סמנים חיסוניים histochemical אמינים בשילוב עם טכניקות ביו-הדמית morphometric מנתח לבחון את ההשפעות של מוטציות גנטיות על תהליכים תאיים ספציפיים. בפרט, אנו מתמקדים ניתוח כמותי של פנוטיפים המשפיעים מורפולוגיה, גודל ומיקום של nuclei בתוך השרירים המפוספסים של הזחלים תסיסנית. תסיסנית הזחל NMJ הוא מודל ניסיוני יקר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המבנה ואת התפקוד של מערכת עצבית-שרירית, הן בבריאות ובחולי. עם זאת, מתודולוגיות מתוארת כאן יכולה להתארך עד מערכות אחרות גם כן.
Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1.
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.
בעבר, וריאציות מורפולוגיים בתוך ובין קבוצות ניסוי לעתים רחוקות נלקחו בחשבון. עם זאת, היישום של שיטות כמותיות חברה הופך לנורמה במחקרים השוואתיים של מורפולוגיה תיאור מתמטי של צורות אנטומיות מחושבת. שימוש ניתוחים כמותיים בהערכת ההשפעות של מניפולציות גנטיות על תהליכים תאיים ספציפיים, הבטחה בשיפור יכולתנו לזהות שינויים מורפולוגיים בשיפור הדיוק שבו שינויים אלה מתוארים. יתר על כן, ניתוח סטטיסטי של נתונים כמותיים מאפשר לנו להעריך האם ההבדלים שנצפו בין פנוטיפים הם משמעותיים.
בשרירים מפוספסים, גרעינים מפגינים מבנה מעוגל ברור והם פזורים באופן אחיד לאורך הסיב השריר. למרות המנגנונים המולקולריים לקביעתם ולקיומם גודל, צורה ואדריכלות של גרעינים אינם ידועים, תכונות גרעיניות אלה לא סבירo לשחק תפקיד בסיסי שליטת תפקוד שרירים. ואכן, כמה myopathies נגרמת על ידי מוטציות בגני ויסות מורפולוגיה ומיקום של גרעינים בתוך שרירים. החשיבות התפקודית של צורה והפצה של גרעינים בתוך תא אינה מוגבלת שרירים. צבירת הראיות עולה כי פגמים הגרעין קשורים גם עם מחלות ניווניות כגון של מחלת פרקינסון 18,24. בנוסף, אנו מתחילים להעריך מורפולוגיה כי, גודל והפצה התאית של אברונים אחרים כולל reticulum endoplasmic ואת המיטוכונדריה יכול להיות השלכות תפקודיות. לדוגמא, שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריה קשורים להפרעות נוירולוגיות כגון מסוג 1 ניוון ראייה (OPA1) ו שארקו-מארי-שן הסוג 2A נוירופתיה 25.
כדי לסייע בתהליך של הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים חשובים אלה, אנו מציעים לשלב confocal ברזולוציה גבוההנתונים עם תוכנות morphometric הדמיה מנתחות להעריך כמותית כיצד מניפולציות גנטיות יכולות להשפיע צורה, גודל, ומיקום של גרעינים בתוך סיבי שריר. העצמה ואת צדדיות של גנטיקה תסיסנית יחד עם טבע השבלונות ביותר של המערכת העצבית-שרירית זחלים תסיסנית להפוך את NMJ זחל מודל ניסיוני מתאים במיוחד עבור סוג זה של ניתוחים. בבית NMJs הזחל, ניתוח פנוטיפי יכול להתבצע ברזולוציה סינפסה אחת ומאפשר ניתוח morphometric מדויק שבו מספר NMJs ניתן ללמוד בתוך אותו זבוב ואפילו באותו NMJ לזיהוי ניתן להשוות בין זבובים של גנוטיפים שונים 3,4.
אפיון פנוטיפי של מיקום, צורה וגודל גרעיני בבית NMJ תסיסנית הזחל מתחיל על ידי ביצוע immunostaining של NMJs גזור עם נוגדנים מדגישים שרירי גרעינים בתוך שרירים. בפרוטוקול מפורט תישל העיתון, myonuclei הוכתמו נוגדנים polyclonal נגד lamin, סמן של מעטפת הגרעין, בטוש גרעיני הדגשת נוגדנים פנים עם גרעיני ספציפי DVAP להכתים את השריר כולו. הנוגדנים lamin השתמשו בניסויים אלה נמסרו באדיבות על ידי פול פישר 19-22 אבל מקורות חלופיים של נוגדנים אנטי-lamin ניתן להשתמש. בנוסף, מספר נוגדנים אחרים ספציפיים עבור מעטפת הגרעין זמין מסחרי. לבסוף, סמנים גרעיניים, כגון DAPI ו יודיד propidium, זמינים גם בעוד שרירים יכולים להיות דמיינו ידי מכתים עם נוגדנים נגד תקטין או אנטי-טובולין. אם נוגדנים אחרים מאלה המשמשים בהליך ניסיוני זה מועסקים, פרוטוקול immunostaining ידרוש תוספת-צעדים בם תנאי קיבעון ריכוזיים עובדים עבור הנוגדנים החדשים יצטרכו להיות מותאמים. שלב קריטי אחת בפרוטוקול זה, במיוחד כאשר הדמיות נפח צריכות להיות מנותחות, הוא הדואר הרכבה של דגימות בשקופית. במקרה זה, חשוב לכלול מפרידים בין השקופיות ואת coverslip כך הדגימות לא תימחצנה. שלוש להקות של קלטת תאית עוטפות את השקף על שני הצדדים של coverslip מייצגות דרך קל להרוויח מפרידים.
בעוד ImageJ שמש תמונות 2D, שרוב התמונה מתקבלת רב ערוצית 3D ניתוחי המוצג במאמר זה, נעשה באמצעות Imaris בגלל הזמינות בתוך הבית שלה. עם זאת, חבילת תוכנה מסחרית דומה אחרת יכולה לשמש עבור יישומים אלה.
ישנן מספר קוד פתוח (למשל, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME ואחרים) ופלטפורמות תוכנה מסחרית זמין עבור ניתוח של תמונות confocal. ImageJ 26, התוכנה החופשית מ- NIH או בגרסתו המשופרת יותר, המכונה פיג'י 27, יש מספר גדול של מסנני יבוא, פקודות מאקרו ותוספות זמינות עבור ותקשורת ההדמיה ברחבי העולםty. רוב התוספים האלה מתמקדים עיבוד המידע על באופן פרוס פרוס בנפרד. ישנם גם תוספים זמינים עבור להדמיה והניתוח של תמונות 3D רבות. עם זאת, הם לעתים קרובות המיועדים משימה מסוימת ומשתמשים עשויים להידרש להרחיב או להתאים תוספים אלה לצרכימים שלהם. מצד השני, פלטפורמות מסחר למקד למשתמשים מנוסים יחסית, ולעתים קרובות הם התמקדו קלים לשימוש, כיסוי רחב של משימות עיבוד תמונה במהירות מדהימה.
הליך הניסוי יחד עם ניתוח פנוטיפי כמותית המפורטים בפרוטוקול זה, יכול לסייע הבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים מורפולוגיה אברון והפיצו בתוך תא. עם זאת, גישה זו יש ההגבלה הברורה של ניתוח תהליכים אלה במבוי-לנקודה מסוימת. תהליך שליטת מורפולוגיה והפצה של אברונים צפוי להיות מאוד דינמי לגוון לא רק בין ty תאים השונהPES אלא גם בתוך התא אותו בהתאם למצב התפתחותי או פיסיולוגי. יישום נוסף של ניתוח זה יהיה מיוצג על ידי הדמית זמן לשגות המאפשרת שינויים במורפולוגיה אברון ותנוחה להיות במעקב לאורך זמן.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).
Micro-Forceps 0.3×0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours |
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS | ||
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |