Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.
Большинство исследований морфогенеза полагаются на качественные описания того, как анатомическое черты страдают от нарушения специфических генов и генетических путей. Количественные описания редко выполняются, хотя генетические манипуляции производят ряд фенотипических эффектов и изменения наблюдаются даже у лиц, находящихся в контрольной группе. Все новые данные показывают, что морфология, размер и расположение органелл играют ранее недооцененной, тем не менее фундаментальную роль в клеточной функции и выживания. Здесь мы предлагаем шаг за шагом инструкции для выполнения количественного анализа фенотипов у дрозофилы личиночной нервно – мышечного соединения (НМС). Мы используем несколько надежных иммуногистохимическое маркеров в сочетании с методами био-визуализации и морфометрического анализа для изучения влияния генетических мутаций на специфических клеточных процессов. В частности, мы обратили внимание на количественный анализ фенотипов влияющих морфологии, размера и положения пuclei в поперечно – полосатых мышцах личинок дрозофилы. Дрозофилы личиночной НМС является ценным экспериментальная модель для изучения молекулярных механизмов , лежащих в основе структуры и функции нервно – мышечной системы, как в отношении здоровья и болезни. Тем не менее, методики мы описываем здесь могут быть распространены и на другие системы, а также.
Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1.
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.
В прошлом, морфологические вариации внутри и между экспериментальными группами редко принимается во внимание. Тем не менее, применение количественных методов в настоящее время становится нормой в сравнительных исследованиях морфологии и математического описания анатомических форм вычисляются. Использование количественного анализа при оценке влияния генетических манипуляций на специфических клеточных процессов, перспективны в укреплении нашей способности выявлять морфологические изменения и в повышении точности, с которой эти изменения описаны. Кроме того, статистический анализ количественных данных позволяет оценить, насколько наблюдаемые различия между фенотипами являются значительными.
В поперечно-полосатых мышц, зародыши обнаруживают отчетливую округлую структуру и равномерно распределены вдоль мышечного волокна. Хотя молекулярные механизмы установления и поддержания размера, формы и архитектуры ядер не известны, эти ядерные возможности, скорее всего, то играют фундаментальную роль в контроле мышечной функции. Действительно, несколько миопатии вызваны мутациями в генах, регулирующих морфологию и положение ядер в мышцах. Функциональное значение формы и распределения ядер в клетке не ограничивается мышцами. Накопленные данные показывают , что ядерные дефекты также связаны с нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Паркинсона 18,24. Кроме того, мы начинаем понимать, что морфология, размер и внутриклеточное распределение других органелл, включая эндоплазматический ретикулум и митохондрии могут иметь функциональные последствия. Например, изменения в митохондриальной морфологии связаны с неврологическими расстройствами , такими как 1- го типа атрофией зрительного нерва (OPA1) и Шарко-Мари-Тута типа 2A нейропатии 25.
Для оказания помощи в процессе выяснении молекулярных механизмов, лежащих в основе этих важных процессов, мы предлагаем совместить с высоким разрешением конфокальнойданных с помощью программного обеспечения визуализации и морфометрического анализа количественно оценить, как генетические манипуляции могут повлиять на форму, размер и расположение ядер в мышечных волокон. Мощность и универсальность дрозофилы генетики вместе с весьма стереотипное характер нервно – мышечной системы у личинок дрозофилы делают личиночной NMJ экспериментальную модель особенно подходит для такого рода анализов. На личиночной NMJs, анализ фенотипической может быть выполнена в одном разрешении синапса , позволяющей точный анализ морфометрического где ряд NMJs можно изучать в то же муха и даже тот же опознаваемый НМС можно сравнивать между мухами разных генотипов 3,4.
Фенотипическая характеристика положения, формы и размера ядерного на дрозофилы личиночной NMJ начинает выполняя иммунное расчлененный NMJs с антителами , которые подчеркивают мышцы и ядра внутри мышц. В протоколе указано в This бумага, миоядер окрашивают поликлональными антителами против ламина, маркера ядерной оболочки, с ядерным маркером подсветкой внутри ядра и антителами, специфичными к DVAP окрасить всю мышцу. Эти Ламин антитела , используемые в этих экспериментах , были любезно предоставлены Paul Fisher 19-22 , но могут быть использованы альтернативные источники анти-ламин антител. Кроме того, ряд других антител, специфичных для ядерной оболочки являются коммерчески доступными. И, наконец, ядерные маркеры, такие как DAPI и пропидийиодидом, также доступны в то время как мышцы могут быть визуализированы с помощью окрашивания анти-актина или анти-тубулина антителами. Если другие, чем те, которые используются в этой экспериментальной методике, антитела используют протокол иммунное потребует дополнительных-шагов, которые должны будут быть оптимизированы условия фиксации и рабочие концентрации для новых антител. Одним из наиболее важных шагов в этом протоколе, особенно когда объем визуализации необходимо проанализировать, является йе крепление образцов на слайде. В этом случае важно, чтобы включать в себя прокладками между предметным и покровным так, что образцы не раздавлены. Три полосы целлюлозы ленты, обернутой вокруг скользят по обе стороны от покровного стекла представляют собой простой способ изготовления проставки.
В то время как ImageJ использовали для 2D-изображений, большинство из многоканального 3D анализ изображения в данной работе, были сделаны с использованием Imaris из-за его доступности в доме. Тем не менее, любой другой аналогичный коммерческий пакет программного обеспечения может использоваться для этих приложений.
Есть несколько открытым исходным кодом (например, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, ледяная, KNIME и другие) и коммерческие программные платформы для анализа конфокальных изображений. ImageJ 26, свободное программное обеспечение от НИЗ или его более расширенная версия, известная как Fiji 27, имеет большое количество импортных фильтров, макросов и плагинов , доступных для всемирной Коммуний визуализациити. Большинство этих плагинов сосредоточены на обработке информации, по кусочку каждого конкретного среза способом. Есть также плагины, доступные для визуализации и анализа многоканальных изображений 3D. Тем не менее, они часто предназначены для конкретной задачи, и пользователи, возможно, потребуется расширить или адаптировать эти плагины к своим собственным потребностям. С другой стороны, коммерческие платформы нацелены относительно неопытных пользователей и часто сосредоточены на простоту в использовании, широкий охват задач обработки изображений с невероятной скоростью.
Экспериментальная процедура вместе с количественным анализом фенотипического, изложенной в данном протоколе, может помочь в выяснении молекулярных механизмов, контролирующих органелл морфологии и их распределение в пределах соты. Тем не менее, этот подход имеет очевидное ограничение анализа этих процессов в определенном конечной точке. Процесс контроля морфологии и распределения органелл, вероятно, будет очень динамичным и варьировать не только между различными клеток TyПЭС, но и в той же клетке в зависимости от развития или физиологического состояния. Дальнейшее осуществление этого анализа будет представлен Промежуток времени визуализации, что позволяет изменения в органелл морфологии и состоянии контролировать с течением времени.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).
Micro-Forceps 0.3×0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours |
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS | ||
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |