माउस वृक्ष के समान सेल सबसेट के अलगाव के लिए एक कुशल और उच्च उपज विधि
Summary
Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.
Abstract
वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) पेशेवर प्रतिजन पेश प्राप्त प्रसंस्करण और प्रतिजन अणुओं पेश टी सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा को आरंभ करने के लिए पर एंटीजन पेश करने के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार कोशिकाओं रहे हैं। वृक्ष के समान कोशिकाओं कई phenotypically और कार्यात्मक विषम सबसेट में विभाजित किया जा सकता है। प्लीहा वृक्ष के समान कोशिकाओं के तीन महत्वपूर्ण सबसेट, plasmacytoid हैं CD8α स्थिति और CD8α Neg कोशिकाओं। plasmacytoid डीसी प्रकार मैं इंटरफेरॉन का प्राकृतिक उत्पादक हैं और विरोधी वायरल टी सेल प्रतिरक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं। CD8α Neg डीसी सबसेट MHC वर्ग द्वितीय प्रतिजन प्रस्तुति के लिए विशेष है और केन्द्र सीडी 4 टी कोशिकाओं भड़काना में शामिल है। CD8α स्थिति डीसी बहिर्जात एंटीजन और CD8 टी सेल भड़काना के पार प्रस्तुति के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं। CD8α स्थिति DCs एक विशेष टी सेल को CD1d अणुओं द्वारा glycolipid एंटीजन की प्रस्तुति पर सबसे कुशल होने के लिए प्रदर्शन किया गया हैएल अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) कोशिकाओं के रूप में जाना जाता आबादी। फ्लाइट 3 ligand के प्रशासन अस्थि मज्जा से वृक्ष के समान सेल progenitors के पलायन की आवृत्ति बढ़ जाती है, अंततः murine मॉडल में परिधीय लसीकावत् अंगों में वृक्ष के समान कोशिकाओं के विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप। हम सेल हस्तांतरण प्रयोगों में इस्तेमाल के विभिन्न डीसी सबसेट के vivo प्रवीणता की तुलना करने के लिए कार्यात्मक वृक्ष के समान कोशिकाओं की बड़ी संख्या को शुद्ध करने के लिए इस मॉडल ढाल लिया है।
Introduction
वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) लगभग चालीस साल पहले की खोज 'के रूप में बड़े तारामय (ग्रीक Dendron) सेल "लसीकावत् अंगों 1 में पाए गए। कई अध्ययनों से पता चला है कि डीसी केवल प्रतिजन कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से भोले टी कोशिकाओं 2 को प्रोत्साहित कर सकते हैं। इन कोशिकाओं के एक प्रमुख कार्य तेज और एंटीजन की प्रस्तुति और उनके कुशल प्रसंस्करण और इनमें से लोड हो रहा है प्रतिजन अणुओं पर है। माउस तिल्ली में, डीसी plasmacytoid और पारंपरिक सबसेट में विभाजित किया जा सकता है। plasmacytoid डीसी CD11c की कम अभिव्यक्ति और B220 और जीआर -1 के उच्च स्तर की विशेषता है। उन्होंने यह भी सतह मार्कर mPDCA1 के लिए सकारात्मक रहे हैं और प्रकार मैं रिसेप्टर 9 (TLR9) ligands की तरह टोल के जवाब में इंटरफेरॉन छिपाना। पारंपरिक डीसी CD11c और MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति के लिए उच्च रहे हैं। वे तीन अलग तरह के सीडी 4, CD8α, DEC205, सीडी के रूप में प्ररूपी मार्कर की सतह अभिव्यक्ति के आधार पर सबसेट में विभाजित किया जा सकता है11b और वृक्ष के समान सेल रिसेप्टर निरोधात्मक 2 (DCIR2, 33D1 एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त) प्रोटीन 3,4। CD8α स्थिति DCs भी cDC1 के रूप में जाना जाता है, इस तरह के CD11b और 33D1 के रूप में माइलॉयड मार्करों के लिए DEC205 के लिए सकारात्मक है, लेकिन नकारात्मक हैं। CD8α Neg DCs भी cDC2 कहा जाता है, 33D1, CD11b और सीडी 4 के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन DEC205 की कमी है। डबल नकारात्मक सबसेट (यानी, दोनों सीडी 4 और CD8α के लिए नकारात्मक) अपेक्षाकृत दुर्लभ है, और DEC205 और 33D1 के लिए नकारात्मक है। यह कम से कम विशेषता सबसेट है और CD8α Neg डीसी के एक कम विभेदित रूप हो सकता है।
विभिन्न डीसी सबसेट में प्ररूपी मतभेद भी उनके vivo कार्यों के लिए करता हूं। CD8α Neg डीसी अत्यधिक phagocytic हैं और मुख्य रूप से सीडी 4 टी कोशिकाओं से 3 MHC वर्ग द्वितीय के माध्यम से बहिर्जात प्रतिजन पेश करने के लिए लगा रहे हैं। इसके विपरीत, CD8α स्थिति डीसी MHC वर्ग मैं पर घुलनशील प्रोटीन प्रतिजन की प्रस्तुति के लिए विशेष कर रहे हैंएक तंत्र में पार प्रस्तुति बुलाया। पार प्रस्तुति के परिणाम इन DCs 5 के सक्रियण की स्थिति पर निर्भर करता है, और या तो साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं (CTLs) या नियामक टी कोशिकाओं 6 2,7 के विकास का विस्तार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। , मोटे तौर पर टी कोशिकाओं 8 का विलोपन में विरोधी DEC205-एंटीबॉडी की मध्यस्थता वितरण परिणामों का उपयोग CD8α स्थिति डीसी को प्रतिजन का लक्ष्य निर्धारण जबकि संक्रमित apoptotic कोशिकाओं से व्युत्पन्न एंटीजन की प्रस्तुति एक मजबूत सीटीएल प्रतिक्रिया 9 लाती है।
पेप्टाइड एंटीजन की मान्यता के अलावा, स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रणाली लिपिड और glycolipid एंटीजन पहचान करने के लिए विकसित किया गया है। ये एंटीजन CD1 अणु है, जो MHC वर्ग मैं-तरह कोशिका की सतह प्रोटीन है कि विभिन्न स्तनधारियों में कई संबंधित रूपों में मौजूद हैं द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं। चूहों में, अत्यधिक संरक्षित CD1 अणु का एक प्रकार CD1d बुलाया glycolipid एंटीजन 10 की प्रस्तुति के लिए जिम्मेदार है। प्रमुख टी कोशिकाओं है कि पहचान CD1d / glycolipid परिसरों की आबादी अपरिवर्तनीय NKT कोशिकाओं (iNKT कोशिकाओं) कहा जाता है। इन कोशिकाओं को एक अर्द्ध अपरिवर्तनीय टी सेल रिसेप्टर (TCR) एक अपरिवर्तनीय TCRα श्रृंखला है कि TCRβ श्रृंखला है कि विविधता 11 सीमित है के साथ रखा जाता है से बना व्यक्त करते हैं। पारंपरिक टी कोशिकाओं पैदा करना और सक्रिय प्रेरक टी कोशिकाओं बनने के लिए अंतर करने की जरूरत है कि विपरीत, iNKT कोशिकाओं को एक प्रेरक जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं और glycolipid प्रशासन 12 के बाद तेजी से जवाब शुरू करते हैं। physiologically प्रासंगिक लिपिड प्रतिजन कोशिकाओं की पहचान अनुसंधान के एक सक्रिय क्षेत्र है, और इस तरह के बी कोशिकाओं, मैक्रोफेज और डीसी के रूप में कई अलग सेल प्रकार इस समारोह में प्रदर्शन करने के लिए सुझाव दिया गया है। हालांकि, यह प्रदर्शन किया गया है कि डीसी के CD8α स्थिति सबसेट प्राथमिक सेल तेज और लिपिड एंटीजन की प्रस्तुति माउस iNKT कोशिकाओं 13 और glycolipid मध्यस्थता सीडी 8 टी कोशिकाओं 14 के पार भड़काना करने के लिए मध्यस्थता है।
ove_content "> विभिन्न प्रतिजन कोशिकाओं द्वारा प्रतिजन प्रस्तुति की क्षमता की तुलना करने के लिए, एक स्पष्ट दृष्टिकोण भोले मेजबान में प्रतिजन के बराबर मात्रा के साथ स्पंदित। शुद्ध APCs इस प्रकार के सेल हस्तांतरण प्रयोगों अक्सर प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं के विभिन्न प्रकार के हस्तांतरण है। हालांकि, पूर्व vivo प्रतिजन इलाज किया डीसी के साथ स्थानांतरण के अध्ययन प्रदर्शन चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि इन कोशिकाओं लसीकावत् अंगों जहां वे कुल 15 कोशिकाओं के कम से कम 2% का गठन में रूप में दुर्लभ आबादी मौजूद है। यह दाता पशुओं में इन कोशिकाओं के विकास को बढ़ाने के लिए इसलिए जरूरी है कि अलगाव प्रोटोकॉल की दक्षता बढ़ाने के लिए।यह ज्ञात है कि आम लसीकावत् और आम माइलॉयड पूर्वज है, जो पीडीसी, सीडी 8 स्थिति और सीडी 8 Neg डीसी सबसेट, एक्सप्रेस एफएमएस से संबंधित रिसेप्टर tyrosine kinase 3 (फ्लाइट -3) की पीढ़ी के लिए आवश्यक हैं। पर इन विवो फ्लाइट 3 ligand (फ्लाइट 3 एल) प्रशासन, emigratफ्लाइट 3 अस्थि मज्जा से पूर्वज कोशिकाओं को व्यक्त करने के आयन वृद्धि हुई है, परिधीय लसीकावत् अंगों की वृद्धि हुई बोने और उनके परिपक्व डीसी संतान 16 के विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप। फ्लाइट -3 की अभिव्यक्ति बी, टी या एन.के. सेल भेदभाव रास्ते के लिए अपनी प्रतिबद्धता के दौरान खो दिया है। इसलिए, केवल न्यूनतम परिवर्तन फ्लाइट 3 एल प्रशासन पर इन कोशिकाओं में मनाया जाता है। डीसी आबादी में इसी प्रकार के विस्तार असर एक B16 मेलेनोमा सेल स्रावित murine फ्लाइट 3L, जो फ्लाइट 3 एल 17,18 के निरंतर प्रणालीगत स्तर प्रदान करने के लिए एक सरल और किफायती तरीका प्रदान करता है लाइन का आरोपण द्वारा उत्पन्न ट्यूमर चूहों में मनाया जाता है। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम फ्लाइट 3 एल स्रावित माउस तिल्ली में सभी सामान्य डीसी सबसेट के विस्तार को प्रोत्साहित करने के लिए, इस प्रकार बहुत इन कोशिकाओं है कि बाद के प्रयोगों के लिए अलग किया जा सकता है की पैदावार बढ़ाने B16-मेलेनोमा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण के आधार पर एक प्रोटोकॉल विकसित किया है । 14 दिनों के चमड़े के नीचे आईएम के बाद – हम लगातार कि 10 के भीतर मिलकुल तिल्ली कोशिकाओं के 60% – फ्लाइट 3 स्रावित ट्यूमर का वृक्षारोपण, चूहों का गठन करने के लिए 40 डीसी के रूप में चिह्नित संवर्धन के साथ तिल्ली का बढ़ना विकसित करना। इन spleens से, अलग डीसी सबसेट उच्च शुद्धता मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल शुद्धि किट कि सबसेट विशेष प्ररूपी मार्कर को रोजगार का उपयोग के साथ अलग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वृक्ष के समान कोशिकाओं प्रमुख पेशेवर टी सेल प्रतिक्रिया की भड़काना में शामिल कोशिकाओं पेश प्रतिजन होने के लिए स्वीकार कर रहे हैं। उनका मुख्य कार्य सर्वेक्षण करने के लिए टी कोशिकाओं को प्रस्तुति के ल?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के रस प्रवाह करने के लिए एनआईएच / NIAID अनुदान AI45889 द्वारा समर्थित किया गया cytometry अध्ययनों FACS कोर आइंस्टीन कैंसर केंद्र (एनआईएच / NCI CA013330) और केंद्र एड्स अनुसंधान के लिए (एनआईएच / NIAID AI51519) द्वारा समर्थित सुविधाओं का उपयोग कर किए गए।
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al. ,2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media | |||
| 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer: | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000- |
2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer’s patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
