Denne protokollen demonstrerer gjennomføringen av en optimalisert N-methyl-D-glucamine (NMDG) beskyttende gjenopprettingsmetode hjernen stykke forberedelser. En enkelt formulering brukes til å få pålitelig sunn hjernens skiver fra dyr i alle aldre og forskjellige eksperimentelle programmer.
Denne protokollen er en praktisk guide til N-methyl-D-glucamine (NMDG) beskyttende gjenopprettingsmetode hjernen stykke forberedelser. Mange studier har validert nytten av denne metoden for å forbedre neuronal bevaring og generelle hjernen stykke levedyktighet. Gjennomføringen av denne teknikken av tidlig adoptert har muliggjort detaljerte undersøkelser i hjernefunksjon bruker forskjellige eksperimentelle programmer og dekker en rekke dyr aldre og områder av hjernen celletyper. Fremgangsmåten er beskrevet for å gjennomføre beskyttende utvinning hjernen stykke teknikken bruker en optimalisert NMDG kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) media formulering og forbedret prosedyre å pålitelig få sunn hjernens sektorene for oppdateringen klemme elektrofysiologi. Med denne oppdatert en betydelig forbedring er observert i hastigheten og påliteligheten av gigaohm forsegle formasjon under målrettet oppdateringen klemme opptak eksperimenter samtidig opprettholde gode neuronal bevaring, dermed tilrettelegge utfordrende eksperimentell programmer. Representant resultatene er gitt flere Nevron oppdateringen klemme opptak eksperimenter til analysen synaptic tilkobling i neocortical hjernen skiver utarbeidet fra ung voksen transgene mus og moden voksen menneske neurosurgical prøver. Videre er optimalisert NMDG beskyttende utvinning metoden av hjernen slicing kompatibel med både unge og voksne dyr, derfor løse en begrensning av den opprinnelige metodikken. Oppsummert, kan en enkelt formulering og hjernen kutting prosedyren implementeres på tvers av ulike arter og aldre å oppnå gode levedyktighet og vev bevaring.
Akutt hjernen stykke forberedelse er en viktig eksperimentell modellsystem i nevrovitenskap. Omtrent halvparten av et århundre, har denne plattformen aktivert dynamisk funksjonelle studier av levende hjernen over en rekke anatomiske hjernen regioner og dyrearter. Om det aktuelle programmet er biokjemi, funksjonell imaging, morfologi eller elektrofysiologi, er det av største betydning å sikre optimal integritet og levedyktigheten til skiver vevet. Det er derfor at svært fleksible juvenile gnager hjernen stykke utarbeidelse (dvs., yngre enn postnatal dag 30 for mus) har vært den mest foretrukne hittil. Problemer å skaffe tilstrekkelig sunn hjernens skiver fra moden voksen og eldre dyr har vist seg for å være en formidabel utfordring for de fleste og har pålagt alvorlige begrensninger for å studere funksjonelle arkitektur modne hjernen. Dette gjelder særlig for oppdateringen klemme opptak, en teknikk som krever gode morfologiske og funksjonelle bevaring og er uunnværlig for å karakterisere detaljerte indre og synaptic egenskaper identifiserte enkelt neurons. For de siste tiårene avhengig det store flertallet av oppdateringen klemme electrophysiologists “beskyttende cutting” metode bruker sukrose-substituert lav Na+ aCSF1 for å forberede sunn hjernens skiver fra juvenile, og i langt mindre grad, ung voksen dyr. Denne metoden er basert på premisset om at passiv Na+ strøm og påfølgende vann oppføringen og celle hevelse under det skive kutte steget er den dominerende fornærmelsen som fører til dårlig overlevelse av neurons, spesielt for disse nervecellene ligger i den overfladisk lag som er mest sannsynlig å opprettholde direkte traumer fra bladet bevegelsen. Men etterlater metoden beskyttende kutte fremdeles mye å være ønsket for hjernen stykke forberedelse fra modne voksen dyr uansett bestemt aCSF formulering implementert.
En enkel, men effektiv løsning på dette problemet har vært beskrevet2,3,4,5,6 og kalt “beskyttende recovery” hjernen skive metoden. Originalversjonen av denne metoden bruker en NMDG-substituert aCSF, som NMDG ble identifisert som den mest allsidige og effektiv blant ulike andre kandidat natrium ion erstatter (inkludert sukrose, glyserol, kolin og Tris). Media utformingen ble ytterligere forbedret med tillegg av HEPES å motstå hjernen stykke ødem og gi sterkere pH bufring7, samt tillegg av kosttilskudd for å motvirke de skadelige virkningene av oksidativt stress (tabell 1). Det var empirisk fastslått at en innledende utvinning inkubasjon trinn i lav Na+, lav Ca2 +, og høy Mg2 + NMDG aCSF umiddelbart etter voksen hjernen vev kutting var både nødvendig og tilstrekkelig for forbedret neuronal bevaring over et bredt spekter av hjernen regioner og celletyper dyr alderen3,5,6.
Spesielt, finnes tidligere inkarnasjoner av hva er nå kalt den beskyttende gjenopprettingsmetode i litteratur1,8,9,10,11,12, 13, selv om potensialet for modne voksen og aldring dyr hjernen skive og patch klemme innspillingen ble ikke gjenkjent, eller vist i disse tidligere arbeider. I tillegg fortsetter nyansert fremgangsmåter for variasjonene å støtte bestemte eksperimentelle programmer4,14,15,16. Kollektive kroppen arbeid av disse rekke forskningsgrupper formidler høy tilliten til robusthet av det beskyttende gjenopprettingsmetode for bedre vev bevaring. Metoden NMDG beskyttende utvinning er nå allment vedtatt og gjennomført inne mange publiserte studier utnytte voksen dyr hjernen stykke forberedelser. Disse akutt skive studiene span neocortical3,17,18, hippocampus15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, mellomhjernen,25,,26,,27,,28,,29og hindbrain30,31,32, 33 , 34 regioner, og en rekke nevrotransmitter og neuromodulator typer, inkludert glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 ,36, dopaminergic24,29,37,38, cholinergic14,37,38, 39, noradrenergic40, og serotonergic27,28 neurotransmission. Metoden er også godt egnet for optogenetic kontroll av neuronal aktivitet i skiver avledet fra transgene dyr3,39 eller etter i vivo viral injeksjoner17,27, 28,40,41,42,43, som vel som funksjonell Ca2 + imaging neuronal aktivitet2,44 ,45,46. Analyser av både kortsiktige plastisitet4,47,48 og ulike former for langsiktig plastisitet16,35,48 har vært rapportert. En fersk studie brukt NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode for å lette omfattende og systematisk undersøkelser av synaptic tilkobling i hjernebarken i eldre voksen mus hjernen skiver med octopatch innspillingen konfigurasjon49 -en kraftig demonstrasjon av verktøyet og robusthet av denne metoden. Den beskyttende gjenopprettingsmetode har selv vært brukt med hell i tidligere uforutsette eksperimentelle sammenhenger, for eksempel, bedre bevaring av blodkar og pericytes i voksen kortikale hjernen skiver50, patch klemme opptak fra transplantert interneuron populasjoner i 1-1,5 år gamle Alzheimers musen modeller20og en voksen hjernen stykke reseptor menneskehandel analysen51.
Følgende protokollen beskriver trinnvise fremgangsmåter for å implementere en optimalisert NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode hjernen stykke forberedelser å forbedre levedyktigheten til akutt hjernen skiver. Prinsippene for forbedret neuronal bevaring er diskutert, samt demonstrasjon av de klare fordelene ved denne metoden for komplekse multi Nevron oppdateringen klemme innspillingen eksperimenter i både unge voksne transgene musen hjernen skiver og moden voksen neurosurgical hjernen skiver. Følgende protokollen er validert for mus fra 21 dager gammel til mer enn ett år, også for menneske neurosurgical prøver fra voksne pasienter.
Na + Spike i forbedrer Gigaohm Seal dannelse og Patch klemme opptak suksess
Den første versjonen av metoden NMDG beskyttende utvinning var spesielt utviklet for voksne og aldring dyr2,5. Betatestere har også søkt å bruke denne metoden på juvenile dyr hjernen slicing (dvs, mus < 30 dager gamle). Det har imidlertid blitt bemerket at i motsetning til fremragende visuelt bekreftet neuronal bevaring med NMDG beskyttende utvinning metoden i denne aldersgruppen, gigaohm segl formasjon kan ofte stall, fører til mislykkede oppdateringen klemme opptak forsøk. Én hypotese er at NMDG kasjoner er lettere fanget i juvenile hjernen skiver i forhold til voksen hjernen skiver og kan hindre segl formasjon; men gigaohm sel kan lett danne mens juvenile hjernen skiver fullstendig senkes i NMDG aCSF (data ikke vist), således indikerer at NMDG aCSF sådan hindrer ikke gigaohm segl formasjon.
Rask overgang fra lav til høy Na+ løsning det første hjerne stykke utvinning trinnet er ferdig forårsaker skade neuronal membraner og perturbs segl formasjon prosessen. Dette er intuitivt at overgangen fra lav til høy Na+, kulde til varme temperatur og dramatisk høyde av Ca2 + Mg2 + forhold kollektivt føre til en massiv oppblomstringen av spontan synaptic aktivitet. Denne hemmende etterpå fasen i hjernen kutting prosedyren er sannsynligvis speil reperfusion skader etter en iskemiske fornærmelse. Dermed ytterligere redusere neuronal membran skade i første restitusjonsfasen en gradvis Na+ pigg innsjekkingsprosedyren har blitt innlemmet som høyden av Na+ konsentrasjon i NMDG beskyttende utvinning inkubasjon kammeret er sakte og reproduserbar opphøyet med presis timing. Som den opprinnelige beskyttende Gjenopprettingsprosedyren er timelige dissosiasjon Na+ høyde fra temperatur og Ca2 +/Mg2 + forholdet høyde gunstig. Men i tillegg Na+ pigg i fremgangsmåten fører til små inkrementelle økninger i ekstracellulære Na+ konsentrasjon over tidlig tidspunkt og stor økning mot slutten tid poeng, og dermed affording hjernevev en mulighet til bedre til stigende Na+ nivåer. Denne fremgangsmåten er et alternativ til gradvis løsning exchange kontrollert av en perfusjonsmåling pumpen eller gravitasjon dryppe linjer som fører til konstant økning i Na+ nivåer og krever oppmerksomhet til både tilsig og utløp å unngå overløp av skive kammeret. Spesielt i denne Na+ stiger pigg innsjekkingsprosedyren osmolality for løsningen i skive kammeret gradvis over en periode på flere minutter før skiver tilbake til normal osmolality løsning, men dette ikke negativt påvirke helsen skive eller oppdateringen klemme opptak suksess. En høy osmolality kutte løsning har tidligere blitt brukt for mellomhjernen skive forberedelser for å bedre bevare dopamin neurons for oppdateringen klemme opptak57,58, dermed demonstrere at dette midlertidige hyperosmolality kan være gunstig i noen sammenhenger.
Ved å implementere en optimalisert prosedyre kombinere NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode og gradvis Na+ er pigg i trinn nytten av denne hjernen skive metoden utvidet for å dekke juvenile gjennom moden voksen dyr aldre. Denne oppdaterte protokollen er nå egnet for en rekke dyr alder bruke en enkelt optimale NMDG aCSF formulering og prosedyre. Eventuelt Na+ pigg i fremgangsmåten kan brukes med en stadig lengre forsinkelse og/eller tregere gang løpet å øke levedyktigheten til hjernen skiver fra eldre dyr, og vi har gitt en grunnleggende veiledning i anbefalte pigg i tidsplaner ifølge dyr alder (se tabell 2). Mens vi gir en grunnleggende rammeverk som er egnet for en rekke applikasjoner, kan avansert forholdsregler utforskes for å ytterligere forbedre levedyktighet og lang levetid på hjernen skiver fra voksne og aldring dyr. For eksempel glutation restaurering strategier er spesielt effektiv i denne henseende og kan implementeres som beskrevet andre steder2,6.
Bedre gjennomstrømming for utfordrende eksperimenter
Analyse av synaptic tilkobling av oppdateringen klemme innspillingen er et krevende program som krever gode bevaring av både neuronal struktur og funksjon for å oppnå en høy pålitelighet av suksess. Som antall nevroner spilles samtidig går lineært, teknisk vanskelighetsgraden går opp supra-lineært. Det er mange feilmodi, og en av de vanligste årsakene til feil er manglende evne til skjemaet tilstrekkelig gigaohm pakninger på ett eller flere av de målrettede cellene. Dette kan dramatisk langsom fremgang, spesielt når tre eller flere neurons må tas opp samtidig. Samsvar med funn av raskere gigaohm forsegle formasjon tid med optimalisert NMDG beskyttende utvinning metoden, var det en markert forbedring i suksessrate og gjennomstrømning multi Nevron oppdateringen klemme opptak eksperimenter med både voksen transgene musen hjernen skiver og voksen neurosurgical hjernen skiver. Forbedret effektiviteten er nesten helt sikkert tilskrives både raskere og pålitelig gigaohm segl dannelse og forbedret neuronal bevaring av skivene med denne protokollen. Selv om denne protokollen fokuserer på fordelene eksplisitt for oppdateringen klemme opptak programmer, er lignende gevinst forventet for andre utfordrende eksperimentelle applikasjoner der hjernen stykke levedyktighet er avgjørende.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Allen Institute for hjernen vitenskap. Forfatterne ønsker å takke Allen Institute grunnleggerne, Paul G. Allen og Jody Allen, for deres visjon, oppmuntring og støtte. Vi takker også Allen Institute kundestøtte for å utføre dyr pleie husbandry og genotyperingteknologi.
Compresstome VF-200 | Precisionary Instruments | VF-200 | Vibrating tissue slicer (recommended) |
N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF constituent |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | aCSF constituent |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5405 | aCSF constituent |
Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71505 | aCSF constituent |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | aCSF constituent |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | aCSF constituent |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | aCSF constituent |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | aCSF constituent |
Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | aCSF constituent |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P5280 | aCSF constituent |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | aCSF constituent |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | aCSF constituent |
2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Anesthetic component 1 |
2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | Anesthetic component 2 |
Curved blunt forceps | Fine Science Tools | 11065-07 | Brain dissection tools |
Fine dissecting scissors (supercut) | Fine Science Tools | 14058-09 | Brain dissection tools |
Large heavy duty scissors 7'' | Fine Science Tools | 14000-18 | Brain dissection tools |
Metal spatula | Sigma Aldrich | Z511455-1PAK | Brain dissection tools |
Razor blades | VWR | 89031-954 | Brain dissection tools |
Brain Slice Keeper-4 | Automate Scientific | S-BSK4 | brain slice holding chamber |
nylon netting | Warner Instruments | 64-0198 | For building small slice recovery chambers |
Pyrex glass beakers (250 mL) | VWR | 89090-434 | For building small slice recovery chambers |
35 mm plastic dish, round | VWR | 100488-376 | For building small slice recovery chambers |
Gas diffuser stones (10 µm) | Sigma Aldrich | 59277 | For constant carbogenation (fine bubbles) |
Agarose Type I-B | Sigma Aldrich | A0576 | For embedding brain specimens |
Micro loader tips | Eppendorf | 22491229 | For filling patch clamp electrodes |
Sylgard | VWR | 102092-312 | For making a custom dissecting platform |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758-100ML | For pH adjustment of media |
Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221465-25G | For pH adjustment of media |
Potassium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221473 | For pH adjustment of media |
Plastic transfer pipets 3 mL graduated | VWR | 89497-676 | For slice transfer |
Zirconium ceramic injector blades | Cadence Specialty Blades | EF-INZ10 | http://cadenceinc.com/ |
KG-33 borosilicate glass capillary w/filament | King Glass Company | custom quote | ID: 0.87mm, OD 1.50mm |
Biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | Intern pipette solution |
Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | Intern pipette solution |
Potassium Gluconate | Sigma Aldrich | G4500-100G | Intern pipette solution |
EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Intern pipette solution |
Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | Intern pipette solution |
Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | Intern pipette solution |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | Intern pipette solution |
Heated water bath (2.5L) | VWR | 13491-060 | Miscellaneous |
Filter paper rounds | VWR | 28456-022 | Miscellaneous |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B000BQRBO6 | Miscellaneous |
Glass petri dish | VWR | 89000-326 | Miscellaneous |
10X Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | Miscellaneous |
30 mL syringes | VWR | BD302832 | Miscellaneous |
1 mL syringes | VWR | BD-309628 | Miscellaneous |
25 5/8 gauge needles | VWR | 89219-292 | Miscellaneous |
Thermomixer (w/1.5 mL tube block) | VWR | 89232-908 | To keep agarose molten |