Metoder for å finne alternative Arrangøren Bruk og transkripsjonsregulering av Murine Bcrp1
Summary
Med den murine ABC-transportør Bcrp1 (ABCG2) som et eksempel, i-silico-protokoller er presentert for å detektere alternativ promoter bruk i gener som blir uttrykt i musevev, og for å evaluere funksjonaliteten av de alternative promotorer som er identifisert ved hjelp av rapportør analyser.
Abstract
Genekspresjon i forskjellige vev blir ofte styrt av alternative promotorer som resulterer i syntese av mRNA med unike – vanligvis utranslaterte – først eksoner. Bcrp1 (ABCG2), murine orthologue av ABC transportør Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), har minst fire alternative arrangører som er utpekt av de tilsvarende fire alternative første eksoner produsert: E1U, E1A, E1B, og E1C. Heri, in-silico protokoller presenteres å forutsi alternativ arrangøren bruk for Bcrp1. Videre er rapportøranalysefremgangsmåter er beskrevet for å fremstille rapportør konstruksjonene for alternative promotorer og for å bestemme funksjonaliteten av mulige aktivatorer oppstrøms av de alternative første eksonene som er identifisert.
Introduction
Mer enn halvparten av menneskets gener er regulert av alternative arrangører 1. Hvert alternativ arrangøren kan inneholde regulatoriske elementer som kan være forskjellige fra de i andre alternative arrangører. Promotoren (e) anvendes i en vev kan være forskjellig fra de som brukes i et annet vev. For eksempel, er det mulig at aktivering av en gitt signalveien kan utløse den alternative promoter for et gen utnyttes i en vev, men har ingen effekt på eller undertrykke en separat alternativ promoter for det samme gen som er benyttet i et annet vev.
Uttrykk for Bcrp1 genet er styrt av alternative arrangører. Bcrp1 er den murine orthologue av det humane brystkreft Resistance protein (BCRP) genet. BCRP er en ATP-bindende kassett (ABC) transporter, formelt utpekt ABCG2 to, tre. Som en apikal plasmamembranprotein, for å BCRP / Bcrp1 funksjoner dyseutstrømningen et bredt utvalg av naturlige og xenobiotiske substrater <sup> 3, 4. Hos mennesker og mus, er BCRP / Bcrp1 sterkt uttrykt i farmakologisk relevante organer som lever (galle canaliculi), tarm og nyre, samt organer med blod-vev barrierer som placenta, hjerne og testis 2, 5 – 12. Uttrykk for BCRP / Bcrp1 i blodkreft og andre stamceller, inkludert kreft stamceller, kan gi resistens av disse cellene til xenobiotics og kreftcellegifter 3.
Tidlig i arbeidet med å forstå regulering av BCRP uttrykk i normale og neoplastiske celler, ble 5 'rask forsterkning av cDNA endene (5'-RACE) analyse av BCRP mRNA utføres for å fastslå den nøyaktige transkripsjonen start side 13. Ikke bare var flere transkripsjonen startsider funnet; også oppdaget var tre alternative former for det første ekson, som i BCRP er uoversatt. Disse alternative første eksoner – utpekt E1A, E1B, E1c – ble uttrykt forskjellig i forskjellige humane vev. Ytterligere to første ekson varianter ble oppdaget i en BLAST søk av menneske EST databasen ved hjelp av andre exon av BCRP 13. Fire kamper avdekket en første ekson> 70 kb oppstrøms ekson 2, som ble utpekt E1u; fire andre kampene avslørte BCRP mRNA som manglet et første ekson helt, som ble utpekt E1- 13. Tilstedeværelsen av alternative leder eksoner er ansett for å være en manifestasjon av alternative promoter bruk 14.
Hos mus er fire alternative første eksoner av Bcrp1 beskrevet som kan tilsvare alternative arrangører som styrer BCRP en transkripsjon i forskjellige muse vev; disse eksoner / arrangører er utpekt E1U, E1A, E1B og E1C, og ligger ca 70, 58, 15 og 5 kb oppstrøms fra Bcrp1 exon 2 5, 15. Den E1A mRNA isoform ble funnet å være dominerende i Murine hematopoetiske stamceller, hjerte, lunge, milt, og hjernen, mens E1B isoform ble uttrykt i mus tarmen, føtale leverceller, og erytroide forløperceller i benmargen 5, 15. Promoteren oppstrøms fra E1B ble vist å være den viktigste alternative promotoren som styrer Bcrp1 transkripsjon i mus tarmen, reguleres i det minste delvis, ved fosfo-cyklisk-AMP responselement bindende protein (p-CREB) og en CREB responselement som er unik for den alternative Bcrp1 promoter 16. Den E1C mRNA isoform er hovedsakelig uttrykt i voksen murine lever og nyre fem. Den E1U isoformen ikke påvises i de fleste vev som ble testet med unntak av muse-testikler, hvor det er den dominerende isoform uttrykt 5. Bcrp1 uttrykt i rotte testiklene finnes i både somatiske (endotelceller tett veikryss, peritubular myoid celler og Sertoli celler) og kjønnsceller (i seminiferøst endotelet, hvor det kan beskytte sent stadium spermatider 4). region oppstrøms fra E1U inneholder en funksjonell respons element for steroidogenic faktor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA og protein er markert redusert i testiklene til Sertoli celle-spesifikke SF-1 knockout mus, noe som tyder på at Bcrp1 uttrykk i murine Sertolicellene styres av SF-1 5.
Protokollene som presenteres detalj metoder for å oppdage alternative første eksoner av Bcrp1 in-silico, og å etablere luciferase-baserte reporter analyser for mulige arrangører oppstrøms fra de alternative første eksoner identifisert.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fleste av metodene og representative resultater som er presentert, er beskrevet i tidligere arbeid med tittelen "B crp1 transkripsjon i mus testikkel styres av en promoter oppstrøms for en ny første ekson (E1U) regulert av steroidogenic faktor-1", som ble publisert i 2013 5 . i tillegg til de representative resultater avbildet her, det forrige papiret gitt estimater for alternative første ekson utnyttelse hjelp 5'-RACE PCR og RT-PCR metodikk. Videre er det i-silico</e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Merit anmeldelse Awards til Douglas D. Ross og til Arif Hussain fra Department of Veterans 'Affairs.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis–an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer’s brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5′ untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol – M2200S. , (2014).
- Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol – Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
