Video Imaging og Spatiotemporal Maps for å analysere gastrointestinal motilitet i Mus

Summary

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Abstract

De enterisk nervesystem (ENS) spiller en viktig rolle i regulering av gastrointestinal (GI) motilitet og kan fungere uavhengig av det sentrale nervesystemet. Endringer i ENS funksjon er en viktig årsak til GI symptomer og sykdom, og kan bidra til å GI symptomer rapportert i nevropsykiatriske lidelser, inkludert autisme. Det er godt etablert at isolerte kolon segmenter generere spontane, rytmiske sammentrekninger kjent som colonic Migrere Motor komplekser (CMMCs). En fremgangsmåte for å analysere den enteriske nevrale regulering av CMMCs i ex vivo preparater av mus kolon, er beskrevet. Tykktarmen er dissekert fra dyret og spylt for å fjerne avføring innhold før den ble innført en kanyle i et organbad. Data samles inn via et videokamera plassert over organbadet og konvertert til høy oppløsning i tid og rom kartene via en in-house programvarepakken. Ved hjelp av denne teknikken, baseline kontraktile mønstre og farmakologiske effekter på ENS funksjon i tykktarmen segments kan sammenlignes over 3-4 timer. I tillegg kan forplantning lengde og hastighet CMMCs registreres samt endringer i tarmen diameter og sammentrekning frekvens. Denne teknikken er nyttig for karakterisering av gastrointestinal motilitet mønstre i transgene musemodeller (og i andre arter, inkludert rotte og marsvin). På denne måte blir farmakologisk induserte endringer i CMMCs registrert i villtype mus og i den Neuroligin-3 ^R451C musemodell for autisme. Videre kan denne teknikk anvendes på andre områder av mage-tarmkanalen inkludert duodenum, jejunum og ileum, og ved ulike utviklings aldre i mus.

Introduction

De enterisk nervesystem (ENS) er den iboende neuronal nettverk av mage-tarmkanalen og modulerer forskjellige funksjoner slik som fordøyelse av tarminnhold, absorpsjon av næringsstoffer og sekresjon og reabsorpsjon av væske. Nerveceller i ENS er lokalisert i myentericus og submukøse plexuses. Den myentericus plexus spiller en viktig rolle i å regulere gastrointestinal motilitet ^en mens submucosal plexus er primært involvert i kontrollen av sekresjon ^2,3. Den plexus myentericus ligger mellom de langsgående og sirkulære muskel lag av tarmveggen. Den kontraktile aktivitet av de glatte muskellagene av tarmveggen forenkler de primære funksjonene til mage-tarmkanalen ved å blande og driver tarminnhold langs lengden av tarmen ^3. Selv om den ytre nerve tilførsel til mage-tarmkanalen fra CNS bidrar til gastrointestinal funksjon in vivo, Er det ENS stand til å regulere gastrointestinal funksjon uavhengig av hverandre. Denne unike egenskap gjør at den funksjonelle undersøkelse av tarm nevrale kretser og deres bidrag til gastrointestinal motilitet ex vivo.

Colonic trekkende motor komplekser (CMMCs) er spontane, nevrogene hendelser som er den dominerende motor mønsteret observert i isolerte mus kolon i fravær av ekskrementpelletene ^4-9. CMMCs er definert som rytmiske kontraksjoner som forplanter seg langs en ​​horisontal avstand som er minst halvparten av den totale lengden av tykktarmen (dvs. fra cecum til endetarmen) ^10. Forholdet mellom CMMCs og kontraktile mønstre som driver ekskrementpelletene er ennå ikke klarlagt, men noen farmakologiske forskjeller har blitt rapportert ^11. Ikke desto mindre evne til ENS for å fungere uavhengig av CNS og eksistensen av neural-mediert motor mønstre i standarden ISolated kolon gir en ideell analysesystem for å undersøke forstyrrelser i bevegeligheten som følge av underliggende ENS dysfunksjon. Spontanitet av gastrointestinale motoriske mønstre gjør funksjonelle endringer i respons til farmakologiske stimuli som skal evalueres.

Bruk av video bildebehandling og spatiotemporal kartlegging ble først utviklet for å kvantitativt undersøke små intestinal peristaltikk i marsvin ^12. Her blir en ex vivo teknikk som er beskrevet som gjør det mulig å studere mus tykktarmsmotilitet mønstre ved hjelp av video-avbildning og analyse av disse opptakene å konstruere høy oppløsning (~ 100 mikrometer, 33 msek)-kart av colonic diameter som en funksjon av posisjon langs kolon og tid (tid og rom kart). Ved hjelp av in-house edge deteksjon programvare (Analyse2, tilgjengelig på forespørsel), er data fra full lengde colonic segmenter entreprenør i sanntid behandlet for å generere tid og rom kart for hvert forsøk. I dette trinnet, video (AVI) -filer er summahovedservice– og konvertert til tid og rom kart ved hjelp Analyse2. Tid og rom kart (figur 2) viser kontraktilitet over tid, og muliggjøre måling av flere parametere, inkludert forplantningshastighet, størrelse, lengde og varighet. Gut diameter er også registrert i løpet av varigheten av forsøket som et mål på den samlede kontraktilitet av vevet segmentet. Denne fremgangsmåten kan anvendes for å identifisere forskjeller i initieringspunkt for kontraktile komplekser som kan indikere forandrede enteriske nerve tilkobling.

En tilsvarende videoavbildningsprotokoll utviklet for å vurdere pellet fremdrift hos marsvin har blitt rapportert ¹³ imidlertid her vi forklarer anvendelsen av videobilled metode for kvantifisering av spontan tykktarmsmotilitet (dvs. i fravær av pellets). Vi gir også detaljert informasjon for å bistå i disseksjon og utarbeidelse av gastrointestinal vev for videobilde tilnærming. Detteprotokollen gir forskere med et tilgjengelig og lett å replikeres verktøy for å analysere enterisk neural kontroll av gastrointestinal funksjon i dyremodeller av sykdom, inkludert genetiske musemodeller.

Den videoavbildningsteknikk muliggjør analyse av tykktarmsmotilitet i respons til forskjellige farmakologiske midler. Legemidler kan administreres via tarmkanalen eller organbadet eksterne til colonic forberedelse. Forskjellige deler av mage-tarmkanalen mus utviser spesifikke motilitet mønstre slik som i tynntarmen segmentering og CMMCs i tykktarmen.

Denne teknikken har blitt anvendt for å identifisere forskjeller i strekk liten tarmfunksjonen; forskjellig sensitivitet til _5-HT3 og _{5-HT-4-antagonister} ble observert i jejunum fra Balb / c og C57 / BL6 mus på grunn av den polymorfe arten av tph2-genet uttrykkes i de to stammene ^6. Effekten av 5-HT-inhibering på motilitet forblir controversielle, som motstridende data har blitt rapportert på betydningen av endogent 5-HT på colonic peristaltikk og CMMCs ^14,15. Endringer i motilitet pre- og postnatalt under utvikling ^7, og effekten av genmutasjoner på gastrointestinal motilitet i dyremodeller av sykdom ¹⁰ kan også bli undersøkt ved å benytte video bildebehandling. Her vi illustrere bruken av fremgangsmåten for et studium av tykktarmsmotilitet i NL3 ^R451C musemodell for autisme, som uttrykker en missense mutasjon i genet som koder for Nlgn3 synaptiske bindingsproteinet, Neuroligin-3 ^16. Denne mutasjonen ble først identifisert i pasienter diagnostisert med autisme spektrum lidelse (ASD) ^17, som er sterkt assosiert med GI dysfunksjon ^18-22. Vi undersøkte om NL3 R451C synaptiske mutasjonen påvirker nerve utganger i ENS ved å bruke videoavbildningsteknikk. Vi presenterer data som kjennetegner CMMCs ved utgangspunktet og som reaksjon på det serotonerge 5HT _3/4 reseptor antagonist tropisetron i NL3 ^R451C musemodell for autisme.

Protocol

Animal håndtering og halshugging av dyr før alle forsøkene ble utført strengt i henhold til protokoller godkjent av forsøk med dyr Utvalget for University of Melbourne (Ethics ID: 1212494,7) 1. Tissue Collection og Dissection Avlive voksne mus ved cervikal dislokasjon. Hvis det er mulig unngå anestesi for å unngå påvirkning på tarmfunksjon via reseptorer plassert i nevronale populasjoner av interesse. Spill dyrets totale kroppsvekt, pin kroppen (via de fire pot…

Representative Results

Opptil 90% av pasientene med ASD oppleve en rekke gastrointestinale lidelser, inkludert diaré og forstoppelse 18,24,25. Men de underliggende årsakene til disse gastrointestinale problemene er ukjent. Mange identifiserte mutasjoner hos pasienter med ASD er forbundet med synaptiske proteiner som bidrar til endringer og forstyrrelser i synaptisk transmisjon eller funksjon. En slik mutasjon i genet som koder for celleadhesjonsmolekylet neuroligin-3 (NL3 R451C), ble identifisert …

Discussion

Ved hjelp av denne videoen avbildningsteknikk, ble CMMC frekvens målt som en indikasjon på tykktarmsmotilitet i villtype og NL3 ^R451C mus, en musemodell av autisme spektrum lidelse ^17. Våre resultater tyder på en reduksjon i antallet CMMCs i mutante NL3 ^R451C-mus sammenlignet med villtype mus i nærvær av 5HT _3/4 reseptorantagonist Tropisetron hvilket antyder at NL3 ^R451C mus oppviser en økt følsomhet for Tropisetron. Derfor foreslår vi at neuroligin-3 R451C…

Materials

Reagents
NaCl (MW: 58.44)	Sigma-Aldrich	S7653-250G
KCl (MW: 74.55)	Sigma-Aldrich	P9333-500G
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01)	Chem Supply	471-500G
MgSO4.7H20 (MW: 246.48)	Chem Supply	MA048
CaCl2.2H2O (MW: 147.02)	Chem Supply	CA033
D-Glucose anhydrous (MW: 180.16)	Chem Supply	GA018-500G
NaHCO3 (MW: 84.01)	Chem Supply	GA018-500G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm	Custom Made		Contact Laboratory Directly
732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR	Dow Corning Australia Pty Ltd	1890573
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning Australia Pty Ltd	1064291
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S	Terumo Medical Corporation	0912-2006
SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL	Terumo Medical Corporation	N/A
1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing	Masterflex	508-008
1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing	Masterflex	508-005
1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing	Masterflex	508-007
1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing	Masterflex	96410 – 14
4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing	Masterflex	96410 – 15
3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing	Masterflex	96410 -16
Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml	Thermofisher Scientific	100-400
CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm
CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm
Water heater  (thermo regulator)	Ratek	TH7000
Logitech Webcam	Logitech
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Virtual Dub – 1.9 11	virtualdub.org
MATLAB R2012a	Graph Pad
Logitech Webcam Software	Logitech