Video Imaging og Maps Spatiotemporal at analysere gastrointestinale motilitet i mus
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
Det enteriske nervesystem (ENS) spiller en vigtig rolle i reguleringen af gastrointestinal (GI) motilitet og kan fungere uafhængigt af centralnervesystemet. Ændringer i ENS funktionen er en væsentlig årsag til GI symptomer og sygdom, og kan bidrage til GI symptomer rapporteret i neuropsykiatriske lidelser, herunder autisme. Det er velkendt, at isolerede kolon segmenter generere spontane, rytmiske sammentrækninger kendt som Colon Overfør Motor komplekser (CMMCs). En procedure til at analysere enterisk neurale regulering af CMMCs i ex vivo præparater af mus kolon beskrives. Tyktarmen dissekeres fra dyret og skylles for at fjerne fækalt indhold, inden den kanyle i et organbad. Data erhvervet via et videokamera anbragt over organbadet og omdannes til høj opløsning spatiotemporale kort via en intern softwarepakke. Ved hjælp af denne teknik, baseline kontraktile mønstre og farmakologiske virkninger på ENS funktionen i tyktarmen segments kan sammenlignes over 3-4 timer. Desuden kan formering længde og hastighed CMMCs registreres samt ændringer i tarmen diameter og sammentrækning frekvens. Denne teknik er nyttig til karakterisering gastrointestinal motilitet mønstre i transgene musemodeller (og i andre arter, herunder rotte og marsvin). På denne måde er farmakologisk inducerede ændringer i CMMCs registreres i vildtypemus og i Neuroligin-3 R451C musemodel for autisme. Endvidere kan denne teknik anvendes på andre områder i mavetarmkanalen, herunder duodenum, jejunum og ileum og på forskellige udviklingsmæssige aldre i mus.
Introduction
Det enteriske nervesystem (ENS) er den iboende neuronale netværk af mavetarmkanalen og modulerer forskellige funktioner såsom fordøjelse af tarmindhold, optagelse af næringsstoffer og sekretion og reabsorption af væske. Neuroner i ENS er placeret i de myenteriske og submukøse plexus. Myentericus plexus spiller en stor rolle i regulering af gastrointestinal motilitet 1 henviser det submukøse plexus er primært involveret i kontrollen af sekretion 2,3. Myentericus plexus ligger mellem de langsgående og cirkulære muskellag i mave væg. Kontraktile aktivitet af glat muskel lag af tarmvæggen letter de primære funktioner i mavetarmkanalen ved blanding og fremdrive tarmindhold langs længden af tarmen 3. Selv om den ydre nerveforsyningen til mavetarmkanalen fra CNS bidrager til gastrointestinal funktion in vivo, ENS er i stand til regulering af gastrointestinal funktion uafhængigt. Denne unikke egenskab gør det muligt funktionelle undersøgelse af enteriske neuronale kredsløb og deres bidrag til gastrointestinal motilitet ex vivo.
Colon migrerer motoriske komplekser (CMMCs) er spontane, neurogene begivenheder, der er den fremherskende motor mønster observeret i isolerede mus kolon i mangel af fecal pellets 4-9. CMMCs defineres som rytmiske sammentrækninger, der udbreder sig langs en horisontal afstand, som er mindst halvdelen af den samlede længde af tyktarmen (dvs. fra coecum til endetarmen) 10. Forholdet mellem CMMCs og kontraktile mønstre, der fremdrive fækalpellets er endnu ikke klart fastlagt, dog nogle farmakologiske forskelle er blevet rapporteret 11. Alligevel evne ENS kan fungere uafhængigt af CNS og eksistensen af neurale-medieret motordrevne mønstre i ISolated kolon giver en ideel analysesystem at undersøge forstyrrelser i motilitet som følge af underliggende ENS dysfunktion. Den spontanitet af gastrointestinale motoriske mønstre giver funktionelle ændringer i respons på farmakologiske stimuli skal evalueres.
Brugen af video billedbehandling og Spatiotemporal kortlægning blev først udviklet til kvantitativt at undersøge små tarmperistaltikken i marsvin 12. Her er en ex vivo teknikken beskrevet som muliggør studiet af muse colon motilitet mønstre ved hjælp af video billeddannelse og analyse af sådanne optagelser at konstruere høj opløsning (~ 100 um, 33 ms) kort af colon diameter som funktion af positionen langs kolon og af tid (spatiotemporale maps). Brug i-hus kant afsløring software (Analyse2, efter anmodning), er data fra fuld længde colon segmenter ordregivende i realtid behandlet for at generere spatiotemporale kort til hvert forsøg. I dette trin video (AVI) filer er summarized og konverteret til spatiotemporale kort ved hjælp Analyse2. Spatiotemporale kort (figur 2) viser kontraktilitet over tid og muliggøre måling af flere parametre, herunder udbredelseshastighed, størrelse, længde og varighed. Gut diameter optages også under hele forsøget som et mål for den samlede kontraktilitet af vævet segment. Denne metode kan anvendes til at identificere forskelle i punkt om indledning af kontraktile komplekser som kunne indikere ændret enterisk neural forbindelse.
En lignende video imaging protokol designet til at vurdere pellet fremdrift i marsvin er blevet rapporteret 13 dog her vi skitsere anvendelsen af videoen imaging tilgang til kvantificering af spontan colon motilitet (dvs, i fravær af pellets). Vi giver også detaljerede oplysninger for at hjælpe dissektion og forberedelse af gastrointestinal væv for video imaging tilgang. Denneprotokol giver forskere med en tilgængelig og nemt gentages værktøj til analyse enterisk neurale styring af gastrointestinal funktion i dyremodeller for sygdomme, herunder genetiske musemodeller.
Videoen imaging teknik muliggør analysen af colon motilitet som reaktion på forskellige farmakologiske midler. Lægemidler kan indgives via tarmlumen eller organbadet uden for colon præparat. Forskellige regioner af muse mavetarmkanalen udviser specifikke motilitet mønstre såsom små intestinale segmentering og CMMCs i tyktarmen.
Denne teknik er blevet anvendt til at identificere strain forskelle i tyndtarmens funktion; differentiel følsomhed over for 5-HT 3 og 5-HT 4-antagonister blev observeret i jejunum af Balb / c og C57 / BL6-mus på grund af den polymorfe beskaffenhed af TPH2 genet udtrykkes i de to stammer 6. Virkningen af 5-HT-inhibering på motilitet forbliver conkontroversielt, da modstridende data er blevet rapporteret om betydningen af endogene 5-HT på colon peristaltikken og CMMCs 14,15. Ændringer i motilitet præ- og postnatalt under udviklingen 7, og virkningerne af genmutationer på gastrointestinal motilitet i dyremodeller for sygdomme 10 kan også undersøges ved at bruge video billeddannelse. Her viser vi brug af metoden til en undersøgelse af colon motilitet i NL3 R451C musemodel for autisme, som udtrykker en missense mutation i Nlgn3 gen, der koder den synaptiske vedhæftning protein Neuroligin-3 16. Denne mutation blev først identificeret i patienter diagnosticeret med autisme spektrum forstyrrelse (ASF) 17, som er stærkt forbundet med GI dysfunktion 18-22. Vi undersøgte, om NL3 R451C synaptiske mutation påvirker neurale udgange i ENS hjælp af video imaging teknik. Vi præsenterer data karakteriserer CMMCs ved baseline og som svar på den serotonerge 5HT 3/4 receptorantagonist tropisetron i NL3 R451C musemodel for autisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brug af denne video imaging teknik, blev CMMC frekvens målt som en indikation af colon motilitet i vildtype og NL3 R451C mus, en musemodel for autisme spektrum forstyrrelse 17. Vore resultater viser en reduktion i antallet af CMMCs i mutante NL3 R451C-mus sammenlignet med vildtype-mus i nærvær af 5HT 3/4 receptorantagonisten tropisetron antyder, at NL3 R451C mus udviser en øget følsomhed over tropisetron. Derfor foreslår vi, at neuroligin-3 R451C mutation ænd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB og ELH-Y blev støttet af det amerikanske Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) til ELH-Y.The May Stewart stipendium-Universitetet i Melbourne tillid finansieret stipendium til MS. Vi takker Ali Taher, Fátima Ramalhosa og Gracia Seger tekniske bidrag.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
- Powell, A. K., O’Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung’s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung’s disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung’s disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?. Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
