Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
Die enterische Nervensystem (ENS) spielt eine wichtige Rolle gastrointestinale (GI) Motilität bei der Regulierung und unabhängig von dem zentralen Nervensystem wirken kann. Änderungen in der ENS-Funktion sind eine Hauptursache für gastrointestinale Symptome und Krankheit und kann zur Anzeige zu gastrointestinalen Symptome bei neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich Autismus beitragen. Es ist bekannt, dass isolierte Kolonabschnitten spontan, rhythmische Kontraktionen bekannt als Kolon-Migration Motor-Komplexe (CMMCs) erzeugen. Ein Verfahren, das enterische neuronale Regulation der CMMCs in Ex-vivo-Präparate von Maus Doppelpunkt zu analysieren beschrieben. Der Doppelpunkt wird aus dem Tier herausgeschnitten und gespült fäkale Inhalte zu entfernen, bevor in einem Organbad kanüliert werden. Die Daten werden über eine Videokamera über dem Organbad positioniert und konvertierte zum hochauflösenden Raum-Zeit-Karten über ein Inhouse-Software-Paket erworben. Mit dieser Technik Muster Grundlinie Kontraktions und pharmakologischen Wirkungen auf ENS Funktion in Doppelpunkt segments kann über 3-4 Stunden verglichen werden. Zusätzlich Ausbreitungslänge und der Geschwindigkeit der CMMCs kann sowie Änderungen in gut Durchmesser und Kontraktionsfrequenz aufgezeichnet werden. Diese Technik ist nützlich, um gastrointestinale Motilität Muster in transgenen Mausmodelle charakterisieren (und in anderen Spezies, einschließlich Ratten und Meerschweinchen). Auf diese Weise pharmakologisch in CMMCs induzierten Veränderungen sind in Wildtyp-Mäusen aufgezeichnet und im Neuroligin-3 R451C Mausmodell für Autismus. Darüber hinaus kann diese Technik auf andere Regionen des GI-Trakts einschließlich der Duodenum, Jejunum und Ileum und in verschiedenen Entwicklungsalter bei Mäusen angewendet werden.
Introduction
Die enterische Nervensystem (ENS) ist die intrinsische neuronale Netzwerk des Gastrointestinaltraktes und moduliert verschiedene Funktionen wie Verdauung von Darminhalt, der Absorption von Nährstoffen und die Sekretion und Resorption von Flüssigkeit. Neuronen der ENS sind in den myentericus und submuköse Plexus entfernt. Der Plexus myentericus spielt eine wichtige Rolle gastrointestinale Motilität 1 während das submuköse Plexus bei der Regulierung ist bei der Steuerung der Sekretion 2,3 primär beteiligt. Der Plexus myentericus zwischen den Längs- und Ringmuskelschichten des Magen-Darm-Wand befindet. Die Kontraktionsaktivität der glatten Muskelschichten der Darmwand erleichtert die primären Funktionen des Magen-Darm-Trakt durch Mischen und Treibdarminhalt über die Länge des Darms 3. Obwohl die extrinsische Nervenversorgung an den Gastrointestinaltrakt vom CNS trägt zu Magen-Darm-Funktion in vivoIst das ENS Magen-Darm-Funktion der Regulierung unabhängig in der Lage. Diese einzigartige Eigenschaft ermöglicht die funktionelle Untersuchung von Darm neuronalen Schaltkreisen und ihren Beitrag zu Magen-Darm-Motilität ex vivo.
Colon-Migration Motor-Komplexe (CMMCs) sind spontan, neurogene Ereignisse, die die vorherrschende Motor Muster in isolierten Maus-Doppelpunkt in Abwesenheit von fäkalen Pellets 9.4 eingehalten werden. CMMCs als rhythmische Kontraktionen definiert, die entlang einer horizontalen Distanz propagieren, die mindestens die Hälfte der Gesamtlänge des Dickdarms (dh vom Blinddarm zum Rektum) 10. Die Beziehung zwischen CMMCs und die Kontraktionsmuster, die fäkalen Pellets treiben wird noch eindeutig festgestellt werden, jedoch einige pharmakologische Unterschiede haben 11 berichtet. Dennoch ist die Fähigkeit des ENS unabhängig von dem CNS und die Existenz von neuralen-vermittelten Bewegungsmuster in der IS zu funktionierenolated Doppelpunkt ist ein idealer Testsystem Störungen der Motilität zu untersuchen, die aus Basis ENS Dysfunktion. Die Spontaneität von gastrointestinalen motorischen Mustern ermöglicht funktionelle Veränderungen in Reaktion auf pharmakologische Reize bewertet werden.
Der Einsatz von Video-Imaging und Raum-Zeit-Mapping wurde zuerst 12 kleine Darmperistaltik bei Meerschweinchen quantitativ zu untersuchen entwickelt. Hier wird ein ex vivo-Verfahren wird beschrieben, dass die Studie von Maus Kolonmotilität Muster mit Videobildverarbeitung und Analyse dieser Aufnahmen ermöglicht hochauflösenden zu konstruieren (~ 100 & mgr; m, 33 msec) Karten von Kolon-Durchmesser als Funktion der Position entlang des Dickdarms und der Zeit (Raum-Zeit-Karten). Mit In-House-Kantenerkennungssoftware (Analyse2; auf Anfrage), Daten aus voller Länge Vertrags Kolon-Segmente in Echtzeit verarbeitet werden für jedes Experiment Raum-Zeit-Karten zu erzeugen. In diesem Schritt, video (AVI-Dateien) sind SummaRized und konvertierte zum Raum-Zeit-Karten Analyse2 verwenden. Raum-Zeit-Karten (Abbildung 2) Kontraktilität im Laufe der Zeit zeigen und die Messung mehrerer Parameter einschließlich Ausbreitungsgeschwindigkeit, Größe, Länge und Dauer ermöglichen. Gut Durchmesser wird auch während der gesamten Dauer des Experiments als Maß für die Gesamt Kontraktilität des Gewebesegments aufgezeichnet. Dieses Verfahren kann angewendet werden, um Unterschiede in der Initiationspunkt der kontraktilen Komplexe zu identifizieren, die veränderte enterischen neuronalen Konnektivitäts hinweisen könnte.
Ein ähnliches Video-Imaging-Protokoll entwickelt Pellet Vortrieb bei Meerschweinchen zu beurteilen hat 13 aber hier berichtet worden, wir die Anwendung des Ansatzes Videobild skizzieren zur Quantifizierung der spontanen Kolonmotilität (dh in Abwesenheit von Pellets). Wir bieten auch detaillierte Informationen in der Präparation und Vorbereitung von Magen-Darm-Gewebe für den Video-Imaging-Ansatz zu unterstützen. DiesProtokoll stellt Forscher mit einem zugänglichen und leicht repliziert Werkzeug für magensaftresistente neuronalen Kontrolle von Magen-Darm-Funktion in Tiermodellen von Krankheiten, einschließlich genetischer Mausmodelle zu analysieren.
Die Videoabbildungstechnik ermöglicht die Analyse von Kolonmotilität in Reaktion auf verschiedene pharmakologische Mittel. Medikamente können über das Darmlumen oder das Organbad außerhalb des Kolon Zubereitung verabreicht werden. Verschiedene Regionen der Maus Gastrointestinaltrakt zeigen spezifische Motilität Muster wie Dünndarmsegmentierung und CMMCs im Dickdarm.
Diese Technik wurde verwendet, um Stamm Unterschiede in Dünndarmfunktion identifizieren; differentielle Empfindlichkeit zu 5-HT 3 und 5-HT 4 -Antagonisten wurden im Jejunum von Balb / c und C57 / BL6-Mäusen durch die polymorphe Natur der TPH2 Gen exprimiert in den beiden Stämmen 6 beobachtet. Die Wirkung von 5-HT-Hemmung auf die Motilität bleibt conumstritten, da widersprüchliche Daten über die Bedeutung des endogenen 5-HT auf colonic Peristaltik und CMMCs 14,15 gemeldet. Veränderungen in der Motilität vor und während der Entwicklung postnatal 7, und die Wirkungen der Gen-Mutationen auf die gastrointestinale Motilität in Tiermodellen der Krankheit 10 kann auch durch die Verwendung von Videoabbildungssucht werden. Hier veranschaulichen wir die Verwendung des Verfahrens für eine Studie von Kolonmotilität im NL3 R451C Mausmodell von Autismus, die eine Missense-Mutation in dem Gen exprimiert NLGN3 Codieren des synaptischen Adhäsionsprotein Neuroligin-3 16. Diese Mutation wurde zum ersten Mal mit der Diagnose Autismus-Spektrum-Störung bei Patienten identifiziert (ASD) 17, die stark mit GI Dysfunktion 18-22 verbunden ist. Wir untersuchten, ob die NL3 R451C synaptischen Mutation neuronalen Ausgänge im ENS mit dem Video-Imaging-Technik betrifft. Wir präsentieren Daten CMMCs an der Basislinie und in Reaktion auf die serotonerge 5H CharakterisierungT 4.3-Rezeptor-Antagonisten Tropisetron im NL3 R451C Mausmodell für Autismus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit diesem Video-Imaging-Technik, wurde ZMMK Frequenz als Hinweis auf Kolonmotilität gemessen in Wildtyp und NL3 R451C Mäusen, einem Mausmodell für Autismus-Spektrum-Störung 17. Unsere Ergebnisse zeigen eine Verringerung in der Anzahl der CMMCs in mutierten Mäusen NL3 R451C im Vergleich zu Wildtypmäusen in Gegenwart des 5HT-Rezeptorantagonist Tropisetron 3/4 darauf hindeutet, dass NL3 R451C Mäusen eine erhöhte Empfindlichkeit gegen Tropisetron aufweisen. Wir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCB und ELH-Y wurden durch das US Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034) unterstützt. NHMRC (1047674) zu ELH-Y.The Mai Stewart Bursary-Universität von Melbourne Vertrauen Stipendium für MS finanziert. Wir danken Ali Taher, Fátima Ramalhosa und Gracia Seger für technische Beiträge.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
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