Glaukom framkallande ordningen i en<em> In Vivo</em> Råttmodell och Hela montering Retina Förberedelse

Summary

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

Glaukom är en sjukdom i det centrala nervsystemet som drabbar retinala ganglieceller (RGC: er). RGC axoner som bildar synnerven bär visuell input till hjärnan för visuell perception. Skador på RGC och deras axoner leder till synförlust och / eller blindhet. Även om den specifika orsaken till glaukom är okänd, är den primära riskfaktorn för sjukdomen ett förhöjt intraokulärt tryck. Glaukom framkallande förfaranden i djurmodeller är ett värdefullt verktyg för forskare som studerar mekanismen för RGC död. Sådan information kan leda till utveckling av effektiva nervskyddande behandlingar som kan hjälpa till att förebygga synnedsättning. Protokollet i detta dokument beskriver en metod för att inducera glaukom – lika förhållanden i en in vivo råttmodell där 50 pl 2 M hyperton saltlösning sprutas in i episklerala venösa plexus. Blanche av fartygen indikerar lyckad injektion. Denna procedur orsakar förlust av RGC att simulera glaukom. En månad efterinjektion avlivas djuren och ögonen avlägsnas. Därefter hornhinnan, linsen och glaskroppen bort för att göra en ögonmusslan. Näthinnan är sedan dras av från bakre delen av ögat och nålas på Sylgard rätter med kaktus nålar. Vid denna punkt, kan nervceller i näthinnan färgas för analys. Resultat från denna laboration visar att cirka 25% av RGC försvinner inom en månad efter det förfarande jämfört med den interna kontrollen. Detta förfarande möjliggör kvantitativ analys av retinal ganglion celldöd i en in vivo rått glaukom modell.

Introduction

Glaukom är en grupp av ögonsjukdomar som påverkar neuroner i näthinnan, specifikt, de retinala ganglionceller ^1-2. Axonerna hos dessa celler konvergerar till att bli synnerven som bär visuell information till hjärnan där sikten är uppfattas. Skador på RGC och deras axoner orsakar därför synfel.

De primära egenskaper som förknippas med glaukom störningar är RGC degeneration och död, förhöjt intraokulärt tryck (lOP) och synnervspapillen cupping och atrofi. Dessa funktioner leder till synfältsbortfall eller fullständig, irreversibel blindhet. För närvarande har glaukom orsakas blindhet i 70 miljoner människor i världen ^3. Som sådan, är det världens tredje största orsaken till blindhet ^4.

Den exakta mekanismen för RGC död i glaukom förblir okänd. Mycket forskning har gjorts för att låsa upp mysteriet. Det är emellertid känt, att den primära riskfaktorn för glaukom är en ökning in intraokulära trycket på grund av oregelbunden spridning av kammarvatten (AH) i den främre ögonkammaren. AH fungerar som en transparent och färglös ersättning för blod i avaskulära främre ögonkammaren. Det ger näring de omgivande cellerna, avlägsnar utsöndrade restprodukter från metaboliska processer, transporter neurotransmittorer och möjliggör cirkulationen av läkemedel och inflammatoriska celler i ögat under patologiska tillstånd ^1.

Upprätthållandet av kammarvatten cirkulation involverar ciliarkroppen och det trabekulära nätverket. Vattenhaltig humor produceras av ciliarkroppen. Den flyter sedan in i den främre kammaren för att upprätthålla den allmänna hälsan hos den okulära vävnaden. 75-80% av kammarvatten utflöde utsöndras aktivt genom icke-pigment ciliära epitelet när fluiden filtreras genom tre skikt av svampliknande vävnad i ciliarmuskeln. Fluid går ut genom det trabekulära nätverket och genom Schlemms kanal som gripatalet in i blodsystemet ⁵ .Det återstående 20 – 25% av utflödet kringgår det trabekulära nätverket och är passivt utsöndras av ultrafiltrering och diffusion genom uveo-skleral reaktionsvägen. Denna väg synes vara relativt oberoende av det intraokulära trycket ^1.

När kammarvatten produktionen och utflödet är i obalans, byggs tryck i ögat. Såsom angivits, är denna ökning av det intraokulära trycket den primära riskfaktorn för utvecklingen av glaukom. Sådant tryck orsakar skador på de intrikata lager av neuroner i näthinnan vid baksidan av ögat. Skador på de retinala ganglion cell axoner av synnerven orsakar hjärnan att inte längre ta emot korrekt visuell information. Som ett resultat, är uppfattningen av sikt förlorad och fullständig blindhet kan förekomma.

Hittills finns det inget botemedel mot glaukom. Olika behandlingsmetoder finns som i första hand syftar till att minska det intraokulära trycket. Dessa inkluderar topiskmedicinering klasser såsom beta1-adrenerga receptorblockerare, eller utvärtes prostaglandinanaloger. Betablockerare minskar det intraokulära trycket genom att minska produktionen av kammarvatten ^7. Prostaglandiner fungerar för att minska det intraokulära trycket genom att öka utflödet av kammarvatten ^8-14. Alfa-adrenergiska agonister och kolsyraanhydrasinhibitorer används också som sekundära behandlingsmetoder. Alpha adrenerga agonister ökar utflödet genom uveosklerala vägen ^15-17. Karbanhydrashämmare minska produktionen av AH genom enzymatisk inhibition ^18. Mycket mer invasiva procedurer används också för att behandla glaukom. Laser trabeculoplasty används för att öka utflödet av kammarvatten ^19. En annan kirurgisk behandling, kallad trabekulektomi skapar en alternativ plats dränering för att filtrera AH när den traditionella trabekulärt vägen är blockerad ^20-21.

Dessa behandlingar har varit kända för att effektivt reducera lOP. Men upp till 40% av glaukompatienter visar normala IOP nivåer som indikerar ett behov av mer kompletta terapeutiska metoder. ^22,23 Dessutom är irreversibel retinal ganglion celldöd ses i glaukom när den börjar och nuvarande behandlingar inte stoppa utvecklingen av sjukdomen ^24-28. Detta har belyst behovet av effektiva neuroprotektiva terapier som riktar sig mot överlevnaden av nervceller själva. Utveckling av glaukom modeller är avgörande för denna utveckling.

I denna studie visar vi en metod för att inducera glaukom liknande effekter hos vuxna Long Evans-råttor med användning av ett modifierat förfarande som ursprungligen beskrivs av Morrison ^29. I detta förfarande, injektioner av 2 M hyperton saltlösning i den episklerala venus plexus inducerar glaukomliknande tillstånd genom ärrbildning vävnad för att minska kammarvattenutflöde i det trabekulära nätverket vilket leder till en ökning i intraokulärt tryck och en betydande förlust av RGC wnom en månad av förfarandet ^30-31. Glaukom framkallande förfaranden, såsom den som beskrivs här, kan vara nyckeln till ny utveckling inom glaukombehandlingar.

Protocol

Alla förfaranden som använder djurförsök har varit i enlighet med de normer för Institute of Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Western Michigan University. 1. Djur Använd han- och honråttor 3 månaders ålder i denna studie. Hålla djuren i en 12 timmar ljus / mörker-cykel med fri tillgång till mat och vatten. 2. Beredning av KAX Cocktail för djurens Anesthesia Lös upp 50 mg xylazin (20 mg / ml) i …

Representative Results

Det här avsnittet visar apparatkomponenter och förfarande som används för att framkalla glaukomliknande tillstånd i en in vivo rått glaukom modell. Vi visar de individuella verktyg och utrustning som används för att utföra en hyperton saltlösning injektion vilket orsakar en ökning av det intraokulära trycket. Vi visar injektion i episklerala venus plexus med sin karakteristiska blanche effekt och den grumliga utseendet hos den främre kammaren som resulterar. Vi besk…

Discussion

Detta protokoll beskriver en metod för att inducera glaukom liknande förhållanden i en in vivo råttmodell. Denna procedur använder en injektion av hyperton saltlösning för att inducera ärrbildning i det trabekulära nätverket ^{29, 32.} Utveckling av ärrvävnad ockluderar utflödet av kammarvatten, vilket ökar trycket i den främre kammaren. Med minskad utflöde och tryck bygga upp, linsen upphängd med elastiska ligament skjuter tillbaka in i glaskroppen kammaren. Glaskroppen gäller sedan t…

Materials

Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75×25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti