Glaucomes induisant une procédure dans un<em> In Vivo</em> Modèle de rat et Whole-mount Retina Préparation

Summary

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

Le glaucome est une maladie du système nerveux central affectant les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). axones RGC constituant le nerf optique portent entrée visuelle au cerveau pour la perception visuelle. Dommages à RGC et leurs axones conduit à la perte et / ou la cécité vision. Bien que la cause spécifique du glaucome est inconnue, le principal facteur de risque de la maladie est une pression intraoculaire élevée. procédures de Glaucome induisant dans des modèles animaux sont un outil précieux pour les chercheurs qui étudient le mécanisme de RGC mort. De telles informations peuvent conduire au développement de traitements neuroprotecteurs efficaces qui pourraient aider à la prévention de la perte de vision. Le protocole dans le présent document décrit un procédé d'induction du glaucome – comme conditions dans un modèle de rat in vivo où 50 ul de 2 M solution saline hypertonique est injecté dans le plexus veineux épiscléral. Blanchir des navires indique injection réussie. Cette procédure entraîne une perte de RGC pour simuler le glaucome. Un mois aprèsinjection, les animaux sont sacrifiés et les yeux sont enlevés. Ensuite, la cornée, le cristallin et vitreux sont enlevés pour faire un œilleton. La rétine est ensuite détachée de l'arrière de l'œil et le tombé sur des boîtes Sylgard en utilisant des aiguilles de cactus. A ce stade, les neurones de la rétine peuvent être colorées pour l'analyse. Les résultats de ce laboratoire montrent que 25% environ de RGC sont perdus dans le mois de la procédure par rapport aux contrôles internes. Cette procédure permet une analyse quantitative de la rétine la mort des cellules ganglionnaires dans un modèle in vivo d' un glaucome chez le rat.

Introduction

Le glaucome est un groupe de maladies oculaires affectant les neurones de la rétine, en particulier, les cellules ganglionnaires de la rétine ^1-2. Les axones de ces cellules convergent pour devenir le nerf optique portant des informations visuelles au cerveau où la vision est perçue. Dommages à RGC et leurs axones provoque donc des défauts visuels.

Les principales caractéristiques associées à des troubles du glaucome sont RGC la dégénérescence et la mort, augmentation de la pression intraoculaire (PIO) et optique de coupe de disque et une atrophie. Ces caractéristiques conduisent à la perte du champ visuel ou complète, une cécité irréversible. À l' heure actuelle, le glaucome a causé la cécité dans 70 millions de personnes à travers le monde ^3. En tant que tel, il est le troisième cause mondiale de cécité ^4.

Le mécanisme exact de RGC la mort dans le glaucome demeure inconnue. Beaucoup de recherches ont été faites pour résoudre le mystère. Il est connu, cependant, que le principal facteur de risque de glaucome est une augmentation in pression intraoculaire due à la circulation irrégulière de l'humeur aqueuse (AH) dans la chambre antérieure de l'oeil. AH agit comme un substitut transparent et incolore pour le sang dans la chambre antérieure de l'oeil avasculaire. Il nourrit les cellules environnantes, élimine les déchets sécrétés des processus métaboliques, transporte les neurotransmetteurs, et permet la circulation des médicaments et des cellules inflammatoires dans l'oeil pendant les états pathologiques ^1.

Le maintien de la circulation aqueuse de l'humour implique le corps ciliaire et le trabéculum. L'humeur aqueuse est produite par le corps ciliaire. Il circule alors dans la chambre antérieure pour maintenir la santé globale du tissu oculaire. 75-80% d'humeur aqueuse est activement sécrétés par la non-pigmentaire épithélium ciliaire lorsque le fluide est filtré à travers trois couches de tissu spongieux dans le muscle ciliaire. Les sorties de fluide à travers le trabéculum et à travers le canal de Schlemm qui empts dans le système sanguin ⁵ .La restante de 20 – 25% du débit contourne le trabéculum et passivement sécrétées par ultrafiltration et la diffusion à travers la voie de uveo-sclérale. Cette voie semble être relativement indépendante de la pression intraoculaire ^1.

Lorsque la production d'humeur aqueuse et de sortie sont hors d'équilibre, la pression augmente dans l'œil. Comme indiqué, cette augmentation de la pression intra-oculaire est le principal facteur de risque pour le développement du glaucome. Une telle pression provoque des dommages aux couches complexes de neurones de la rétine à l'arrière de l'œil. Les dommages aux axones des cellules ganglionnaires de la rétine du nerf optique provoque le cerveau pour ne plus recevoir de l'information visuelle précise. En conséquence, la perception de la vision est perdue et la cécité complète peut se produire.

À ce jour, il n'y a pas de remède pour le glaucome. Différentes méthodes de traitement existent qui visent principalement à réduire la pression intraoculaire. Ceux-ci comprennent topiqueclasses de médicaments tels que les bloqueurs des récepteurs beta1-adrénergiques, ou analogues de prostaglandines topiques. Les bêta – bloquants réduisent la pression intra – oculaire en diminuant la production d'humeur aqueuse ^7. Les prostaglandines fonctionnent pour diminuer la PIO en augmentant l'écoulement de l' humeur aqueuse ^8-14. Alpha-adrénergiques et des inhibiteurs de l'anhydrase carbonique sont également utilisées comme méthodes de traitement secondaire. Alpha agonistes adrénergiques augmentent sortie par la voie uvéoscléral ^15-17. Les inhibiteurs de l' anhydrase carbonique réduisent la production de AH par inhibition enzymatique ^18. Une grande partie des procédures plus invasives sont également utilisés pour traiter le glaucome. Trabéculoplastie au laser est utilisé pour augmenter l'écoulement de l' humeur aqueuse ^19. Une autre thérapie chirurgicale, appelée trabéculectomie, crée un autre site de drainage pour filtrer AH lorsque la voie trabéculaire traditionnelle est bloqué ^20-21.

Ces options de traitement ont été connus pour effcacement réduire la PIO. Toutefois, jusqu'à 40% des patients atteints de glaucome montrent des niveaux de PIO normales indiquant un besoin de méthodes thérapeutiques plus complètes. ^22,23 De plus, la rétine la mort des cellules ganglionnaires vu dans le glaucome est irréversible une fois qu'il commence et les traitements actuels ne pas arrêter la progression de la maladie ^24-28. Cela a mis en évidence la nécessité pour les thérapies neuroprotectrices efficaces qui ciblent la survie des neurones eux-mêmes. Développement de modèles de glaucome est crucial pour ce développement.

Dans cette étude , nous démontrons une méthode d'induction des effets du glaucome comme chez les rats adultes Long Evans en utilisant une procédure modifiée initialement décrite par Morrison ^29. Dans cette procédure, les injections de 2 M solution saline hypertonique dans le plexus veineux épiscléral induit des conditions de glaucome comme par le tissu des cicatrices pour réduire humeur aqueuse dans le trabéculum conduisant à une augmentation de la pression intra-oculaire et une perte importante de RGC wSEIN d' un mois de la procédure ^30-31. procédures de Glaucome induisant, telles que celle décrite ici, peut être la clé pour débloquer de nouveaux développements dans les traitements du glaucome.

Protocol

Toutes les procédures en utilisant des sujets animaux ont été en conformité avec les normes de l'Institut de protection des animaux et l'utilisation Commission (IACUC) à l'Université Western Michigan. 1. Les animaux Utilisez rats mâles et femelles de 3 mois dans cette étude. Garder les animaux dans un cycle de 12 heures de lumière / obscurité avec un accès libre à la nourriture et de l'eau. 2. Préparation de K…

Representative Results

Cette section illustre les composants de l' appareil et la procédure utilisée pour induire des conditions de glaucome comme dans un modèle in vivo de glaucome chez le rat. Nous montrons les différents outils et l'équipement utilisés pour effectuer une injection de solution saline hypertonique qui provoque une augmentation de la pression intraoculaire. Nous montrons l'injection dans le plexus veineux épiscléral avec son effet de blanchiment caractéristique et…

Discussion

Ce protocole décrit un procédé pour induire des conditions de glaucome analogue dans un modèle in vivo chez le rat. Cette procédure utilise une injection de solution saline hypertonique pour induire une cicatrisation dans le trabéculum ^{29, 32.} Le développement du tissu cicatriciel obture l'écoulement de l' humeur aqueuse qui augmente la pression dans la chambre antérieure. Avec une diminution des sorties et l'accumulation de pression, la lentille suspendue par des ligaments élas…

Materials

Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75×25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti