An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Alla nästa generations sekvensering (NGS) förfaranden inkluderar analyser utförda på laboratoriebänken ( "våt bänk") och dataanalyser genomförs med hjälp av bioinformatik rörledningar ( "torr bänk"). Båda delarna är nödvändig för att producera exakta och tillförlitliga resultat, som är särskilt kritisk för kliniska laboratorier. Riktade NGS teknik har alltmer funnit nåd för onkologiapplikationer för att hjälpa förväg mål precision medicin, men de metoder som ofta involverar bortkopplad och rörlig våt- och torrbänkarbetsflöden och okoordinerade reagensuppsättningar. I denna rapport beskriver vi en metod för sekvense utmana cancerprover med en 21-gen panel som ett exempel på en samlad målinriktad NGS systemet. Systemet integrerar funktionella DNA kvantifiering och kvalificering, single-röret multiplex PCR anrikning, och bibliotek rening och normalisering med hjälp av analytiskt verifierade, single-source-reagens med en fristående bioinformatik svit.Som ett resultat, samtal korrekt varianten från låg kvalitet och låg kvantitet formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) och fin-needle aspiration (FNA) tumörbiopsier kan uppnås. Metoden kan rutinmässigt bedöma cancerassocierade varianter från en ingång 400 amplifierbara DNA-kopior, och är modulärt uppbyggt för att rymma nya genen innehåll. Två olika typer av analytiskt definierade kontroller ger kvalitetssäkring samt skydda samtals noggrannhet med kliniskt relevanta prover. En flexibel "tag" PCR-steget bäddar plattformsspecifika adaptrar och indexkoder för att tillåta prov barcoding och kompatibilitet med gemensam stationär NGS instrument. Viktigt är protokollet strömlinjeformad och kan producera 24 sekvens redo bibliotek på en enda dag. Slutligen förbinder strategi vått och torrt bänk processer genom att införliva pre-analytiskt prov kvalitetsresultat kontroll direkt i varianten ringer algoritmer för att förbättra mutation noggrannhet upptäcka och särskilja falskt negativa och indetermmedfödd samtal. Detta riktade NGS metod använder framsteg inom både wetware och mjukvara för att uppnå hög djup, multiplex sekvensering och känslig analys av heterogena cancerprover för diagnostiska tillämpningar.
Precision medicin bygger på individualisering av diagnostiska och terapeutiska alternativ för patienter. Löftet om skräddarsydda behandlingar är en direkt följd av en bättre förståelse av vägar sjukdomstillstånd som kan informera kopplingen mellan molekylär diagnostik och målsökande behandling. Till exempel användning av molekylärt inriktade terapier ökade från 11% till 46% från 2003 till 2013 1 och anti-cancerläkemedel sådana som vemurafenib och crizotinib är FDA-godkänt med följeslagare diagnostiska tester. Med sin förmåga att korrekt återhämta låg överflöd sekvens mål över mycket multiplexerade provuppsättningar, har nästa generations sekvensering (NGS) dykt upp som en metod för val för att utvärdera genetiska avvikelser i samband med cancer och identifiering av molekylära mål för precisions medicin.
De vanligaste solida tumörbiopsier för molekylär testning inkluderar formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) och fin nål aspiration (FNA) specimILE. Dessa prover är fylld med låg mängd och / eller låg kvalitet nukleinsyror som utmanar korrekt NGS bedömningar 2-5. Nuvarande kommersiella NGS metoder för analys av dessa prover är baserade på ett lapptäcke av olika reagenser, protokoll och dataverktyg som representerar rörliga mål av ständiga förbättringar. Till exempel förändringar i analyskemi och / eller programvara inträffade var 1-2 månader för de mest allmänt använda riktade NGS kit 6. Denna instabilitet återspeglar en brist på samstämmighet i att konstruera och verifiera ett enat NGS-system för krävande provtyper, i synnerhet för cancertestning, och sätter en orimlig börda på laboratorier för att utveckla sammanhängande protokoll som är optimerade från prov till resultat. Faktum är att en färsk undersökning av NGS användare betonade svårigheterna med dessa "snabbt föränderliga" teknik, tillsammans med kraven för etablerade, medicinskt angripbara innehåll, förankrade bioinformatik expertis, en solidifiEd och integrerat förfarande som kan genomföras snabbt och strömlinjeformade arbetsflöden och förenklade protokoll som underlättar on-the-job training 7. I den här artikeln, är ett omfattande system för riktade NGS beskrivs som tar dessa luckor.
Den presenterade metoden integrerar alla processuella åtgärder från pre-analytiska till post-analytisk både våta och torra bänkar att förbättra noggrannheten, känslighet och tillförlitlighet mål kvantifiering och detektion av NGS av kliniskt relevant cancer genloci. Detta tillvägagångssätt börjar med kvantifiering av "funktionell" DNA 4 för att utvärdera DNA-kvalitet, guide matas in i PCR-anrikningssteg, och skydda mot falskt positiva samtal som kan uppstå vid förhör av mycket låga templatkopior. En enda rör multiplex PCR berikar sedan för 46 loci i 21 cancergener med enbart 400 amplifierbara DNA-kopior, följt av inkorporering av plattformsspecifika sekvenser för NGS using vanliga skrivbordssekvenseringsinstrument. Bibliotek renas med hjälp av en enkel magnetisk pärla förfarande och kvantifieras med en roman, kalibrering fritt qPCR analys. En fristående bioinformatik svit, informerades prov DNA QC resultat för att förbättra samtals prestanda, ger sekvensanalys efter NGS. Vi presenterar data med hjälp av detta system strategi för riktad NGS att avslöja bas-substitutionsmutationer, inför / deletioner (InDels), och antalet exemplar varianter (CNVs) i låg kvalitet och låg mängd tumörbiopsier såsom FFPE och FNA prover och kör kontroller.
NGS teknik har omdefinierat förväntningar förhöra de molekylära profiler tumörbiopsier i kliniska situationer 9. Ett antal riktade NGS paneler har utvecklats som forskningsteknik, laboratorie utvecklat tester och kommersiellt tillgängliga produkter och anpassade paneler för att bedöma flera olika typer av kliniska prover 3,5,10-15. Rapporter från flera studier har visat värdet av NGS som en känslig och specifik klinisk verktyg för detektion av genomiskt förändringar 3,10-12,14. Ändå studier har också visat att risken för artefakter som kan orsaka falskt positiva resultat från utmanande cancer biopsier såsom FFPE prover 2-5,12,14. Dessutom har de senaste publikationerna markerade höga felfrekvens för NGS använder onkologi prover 16 och falskt positiva samtal med kommersiella riktade NGS paneler som förvärras genom användningen av lågintensivt DNA 12. Som ett resultat, en del laboraTories har antingen ändrats eller lagts till ytterligare kontroller och avvägningar för att kommersiellt tillgängliga riktade NGS teknik för att förbättra prestanda, ofta för att säkerställa riktigheten eller bekräfta resultaten från bioinformatiska analyser 5,10,11.
21-genen panel (Figur 2) utvecklades som riktat innehåll för en omfattande NGS system för att förhöra evidensbaserade, genomförbara mutationer i utmanande provtyper såsom FFPE och FNA tumörbiopsier. Arbetsflödet har ett antal fördelar: 1) konsistens genom att tillhandahålla en enhetlig amplikon täckning (figurerna 3 och 4, tabell 3); 2) enkel att använda genom att tillhandahålla pre formulerade, optimerade reagensuppsättningar, och förenkla bioinformatik krav; 3) effektivitet genom att effektivisera arbetsflödet och minska antalet pipetteringssteg jämfört med andra kommersiella NGS metoder; och 4) noggrannhet genom att införliva en DNA QC analys för att bedöma amplifikan DNA-kopieantal för att säkerställa acceptabel mall mångfald och undvika stokastiska fluktuationer i variant upptäckt fyra. Integrationen av pre-analytiska QC data med bioinformatik analys möjliggör låga ingångar FFPE DNA. Detta uppnåddes genom att utbilda ett beslutsträd algoritm där olika funktionella kopior av DNA ingång över 400 FFPE prover med oberoende åtgärder av sanning, och införliva denna algoritm i bioinformatik programvara. Som ett resultat, den rekommenderade ingången på 400 amplifierbara kopior, typiskt motsvarande ~ 5-20 ng av FFPE-DNA, kan med fördel jämföras med andra metoder 10-12, inklusive hybridisering baserade anrikning där ~ 250 ng av FFPE DNA rekommenderas 17,18 . Även om den teknik beskrivs för användning på en MiSeq plattform kan den modifieras med användning av Tag PCR-primrar med instrumentspecifika adaptrar för att göra det möjligt för sekvensanalys på andra NGS plattformar.
Flera steg är avgörande för att säkerställa framgångav förfarandet. Pre-analytiska QC analys bestämmer amplifierbara kopietalet av DNA och rapporter funktionell hämning. Men om mindre än 400 amplifierbara DNA-kopior används i PCR anrikningssteg, finns det en ökad risk för falskt negativa samtal från prover med låg förekomst mutationer (Figur 6). Dessutom måste man vara försiktig vid biblioteket rening för att förhindra övertorkning av de magnetiska pärlorna under tvätt- eller elueringssteg. Vidare är framgångsrik bibliotek kvantifiering starkt beroende av den exakta utspädningen av biblioteks-DNA. För bästa resultat, skillnaden mellan qPCR resultat för provet biblioteket (Cq FAM) jämfört med LQ Standard (Cq VIC) bör vara ≤3.3 Cq. Om skillnaden är större än 3,3 Cq, re-spädning och testning av provet rekommenderas. Även en utmärkt korrelation har observerats mellan denna konkurrens qPCR metod och kommersiella kit som erbjuder absolut kvantifiering med hjälp av en standardkurva, En förskjutning av biblioteket input i den klonala amplifieringssteget i förhållande till andra metoder kan vara nödvändiga för att uppnå optimal såddtäthet.
Vissa cancerprover är särskilt utmanande att sekvensera grund av hämmare som kvarstår efter DNA-isolering. För att identifiera dessa prover innan biblioteket förberedelse, qPCR QC analys detekterar även förstärkning hämning genom att inkludera en exogen mall som fungerar som både en intern kontroll och en sentinel för funktionell hämning. Ett exempel visas i fig 3, i vilken en melanom-DNA-prov inte klarar de QC inhibering metriska före sekvensering och sedan misslyckats med att generera ett bibliotek som skulle kunna sekvenseras. Misslyckandet var sannolikt en följd av melanin kontamination, en känd PCR-hämmare, som överförts från FFPE DNA isoleringssteget. Prover som identifieras av QC analys för att vara i riskzonen för förstärkning fel kan räddas genom en extra sanering steg to ta bort potentiella inhibitorer.
Den riktade 21-genen panel fokuserar på evidensbaserade gen hotspots och tillhandahåller ett komplett system med optimerade reagenser och kontroller för DNA QC, NGS och bioinformatik mjukvara som informeras av pre-analytiska "funktionella" DNA kvantifiering resultat. Metoden identifierar exakt bas-substitutionsmutationer och InDels från lågintensivt DNA, och ger ett exempel på ett NGS-system med möjlighet att utöka innehåll panelen för att upptäcka ytterligare varianter som CNVs och anpassas för riktad RNA-sekvensering.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Annette Schlageter för granskning av manuskriptet. Detta arbete stöddes delvis av bidrag CP120017 från Cancer Prevention och Forskningsinstitut Texas (PI: GJL).
2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
ROX | Asuragen | 145346 | |
Diluent | Asuragen | 145339 | |
DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
AIL001 – AIL048 (48) | |||
Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
AIL049 – AIL096(48) | |||
2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
Illumina MiSeq | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
Quantidex Reporter Software | Asuragen |