الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر
Summary
عن طريق تجميع الحمض النووي، وناقلات كريسبر متعددة يمكن بناؤها بالتوازي في رد فعل الاستنساخ واحد، مما يجعل بناء أعداد كبيرة من كريسبر ناقلات مهمة بسيطة. الطماطم جذور شعر هي نظام نموذجا ممتازا للتحقق من صحة ناقلات كريسبر وتوليد مواد متحولة.
Abstract
Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.
Introduction
القدرة على توليد التعديلات الحمض النووي المستهدفة مع كريسبر / Cas9 لديها امكانات كبيرة لدراسات الجينوم وظيفية. هناك نوعان من مكونات كريسبر / نظام Cas9. ونوكلياز Cas9، والمستمدة من المقيحة المكورات العنقودية وجزيء ما يقرب من 100 الإقليم الشمالي دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) الذي يوجه Cas9 إلى الموقع الحمض النووي المستهدفة (ق) 1. وتمنح الاعتراف استهداف من قبل لأول مرة ~ 20 الإقليم الشمالي من gRNA، والذي يسمح لإنتاج عالية الإنتاجية من ناقلات تستهدف 2،3. معظم الكائنات الحية التي يمكن هندستها، وقد تم بالفعل مع كريسبر التكنولوجيا / Cas9 4،5.
في النباتات، والمروجين التأسيسي، مثل المروج CaMV 35S، وتستخدم عادة لدفع التعبير عن نوكلياز Cas9 6. يتم التعبير عن gRNAs باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز الثالث U6 أو U3 المروجين الذي يقيد قاعدة الأولى من gRNA إما G، لU6، أو ألف لU3، عن النسخ كفاءة. ومع ذلك RNA البلمرة الثاني حفلة موسيقيةoters، التي تكون خالية من هذه القيود، وقد استخدمت أيضا 7،8.
gRNAs مختلفة لحث طفرات الحمض النووي مع كفاءات مختلفة، وذلك يمكن أن يكون من المهم للتحقق من صحة أولا ناقلات كريسبر قبل الاستثمار في التحولات كامل النبات أو إنشاء شاشات المظهرية واسعة النطاق. التعبير عابر كريسبر يبني في النباتات، وذلك باستخدام تسريب الأجرعية على سبيل المثال، ينتج عموما في أدنى تردد من تعديل الحمض النووي بالمقارنة مع النباتات مستقرة 6، مما يجعل الكشف عن الطفرات صعبة وفحوصات المظهري غير عملي مع هذه النهج. ما يسمى جذور شعر هي، نظام بديل مناسب لأن عددا كبيرا من المواد مستقلة، تحولت مستقر يمكن أن تتولد في غضون أسابيع، على العكس من أشهر النباتات مستقرة. ناقلات كريسبر فعالة جدا في إحداث طفرات الحمض النووي في جذور شعر 9،10.
طرق تجميع الحمض النووي ligate بكفاءة شظايا الحمض النووي التي تحتوي على overlapping ينتهي 11. والميزة الرئيسية لبعض أساليب تجميع الحمض النووي هو القدرة على دمج ssDNA (أي oligos) في تجميع المنتجات. منذ gRNAs ليست سوى ~ 20 NT طويلة وأهداف جديدة يمكن مع oligos توليفها، وهذه الأساليب تجميع الحمض النووي هي مناسبة تماما لاستنساخ كريسبر. وتستند هذه البروتوكولات المذكورة هنا على سلسلة P201 ناقلات كريسبر التي استخدمت بنجاح في فول الصويا 10، الحور 12 والآن الطماطم. إجراء الاستنساخ قدم ويقدم العديد من المزايا على طريقة الاستنساخ الحالي 10. وهي ناقلات تعمل بكامل طاقتها ويمكن أن تتولد في رد فعل الاستنساخ واحد في يوم واحد. ويمكن أيضا بناء ناقلات تكون مجمعة لتوليد ناقلات كريسبر متعددة في نفس الوقت، وكذلك الحد العملي على الوقت وتكاليف المواد. نقدم أيضا على بروتوكول لتوليد الطماطم جذور شعر باعتباره وسيلة فعالة لإنتاج المواد المعدلة وراثيا مع الحذف الجينات المستهدفة. وتستخدم جذور شعر لصالحةأكل ناقلات كريسبر وتوفير المواد اللازمة لتجارب لاحقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes17,18, or overlap-extension PCR19. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل منحة المؤسسة الوطنية للعلوم IOS-1025642 (GBM). نشكر ماريا هاريسون لتوفير سلالة ARqua1.
Materials
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' -> 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGAAATTTATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTGAAG | ||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT | ||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTCAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTAGATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG | Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. | |||
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA – A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
