High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots
Summary
Verwendung von DNA-Baugruppe können mehrere CRISPR Vektoren parallel in einem einzigen Reaktions Klonierung konstruiert werden, wodurch die Konstruktion einer großen Anzahl von CRISPR Vektoren eine einfache Aufgabe. Tomato Haarwurzeln sind ein ausgezeichnetes Modellsystem CRISPR Vektoren zu validieren und mutierten Materialien erzeugen.
Abstract
Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.
Introduction
Die Möglichkeit, gezielte DNA-Modifikationen mit CRISPR zu erzeugen / Cas9 hat ein großes Potenzial für funktionelle Genomik Studien. Es gibt zwei Komponenten des CRISPR / Cas9 Systems; die Cas9 Nuklease, abgeleitet von Staphylococcus pyogenes und einer etwa 100-nt Führungs RNA (gRNA) Molekül , das Cas9 die gezielte DNA – Stelle (n) 1 leitet. Zielerkennung wird durch den ersten übertragenen ~ 20-nt der gRNA, die für Hochdurchsatzproduktion von Targeting – Vektoren 2,3 ermöglicht. Die meisten Organismen , die so konstruiert werden können, bereits mit CRISPR / Cas9 Technologie 4,5 haben.
In Pflanzen, konstitutive Promotoren, wie den CaMV 35S – Promotor, werden üblicherweise zum Antrieb der Expression der Nuklease Cas9 6 verwendet. Die gRNAs exprimiert werden, die RNA-Polymerase III U6 oder U3 Promotoren, die die erste Basis des gRNA schränkt entweder ein G, für U6 oder A für U3, für eine effiziente Transkription. Allerdings prom RNA-Polymerase IIOters, die frei von diesen Beschränkungen sind, wurden ebenfalls 7,8 verwendet.
Verschiedene gRNAs DNA-Mutationen mit unterschiedlichen Effizienzen, induzieren und so kann es wichtig sein, um erste CRISPR Vektoren validieren, bevor in Ganzpflanzentransformationen zu investieren oder umfangreiche phänotypische Bildschirme einrichten. Transiente Expression von CRISPR – Konstrukte in Pflanzen durch Agroinfiltration beispielsweise unter Verwendung, führt im allgemeinen zu einer niedrigeren Frequenz Modifikations DNA im Vergleich zu stabilen Pflanzen 6, was den Nachweis von Mutationen schwieriger und phänotypischen Assays unpraktisch mit solchen Ansätzen. Sogenannte Haarwurzeln sind eine bequeme, alternative System, da eine große Anzahl von unabhängigen, stabil transformierte Materialien können innerhalb von Wochen erzeugt werden, wie für eine stabile Pflanzen Monate gegenüber. CRISPR Vektoren sind sehr effektiv DNA – Mutationen in Haarwurzeln 9,10 bei der Induktion.
DNA-Montageverfahren abzubinden effizient DNA-Fragmente enthalten, überlastapping Enden 11. Ein wesentlicher Vorteil einiger DNA Montageverfahren ist die Fähigkeit , ssDNA (dh Oligos) in die zusammengesetzten Produkte einzuarbeiten. Da gRNAs nur ~ 20-nt lang und neue Ziele sind mit synthetisierten Oligos hergestellt werden, sind diese DNA-Montageverfahren gut zu CRISPR Klonen geeignet. Die Protokolle werden hier beschrieben auf der P201 – Reihe von CRISPR Vektoren basieren , die 10 Sojabohnen-, Pappel 12 erfolgreich eingesetzt wurde und nun Tomate. Das Klonierungsverfahren präsentiert bietet mehrere Vorteile gegenüber dem aktuellen Klonmethode 10. Nämlich voll funktionsfähige Vektoren können in einem einzigen Reaktions Klonierung in einem einzigen Tag erzeugt werden. Vektorkonstruktion kann auch mehrere CRISPR Vektoren parallel weiter zu reduzieren Handhabungszeit und Materialkosten zu erzeugen gepoolt werden. Wir stellen auch ein Protokoll für die Erzeugung von Tomatenhaarwurzeln als eine effiziente Methode transgenen Materialien mit Zielgen Deletionen zu erzeugen. Hairy Wurzeln sind gültig verwendetaßen die CRISPR Vektoren und liefern Material für nachfolgende Experimente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes17,18, or overlap-extension PCR19. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der National Science Foundation Grant IOS-1025642 (GBM) unterstützt. Wir danken Maria Harrison für den ARqua1 Stamm bereitstellt.
Materials
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' -> 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGAAATTTATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTGAAG | ||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT | ||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTCAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTAGATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG | Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. | |||
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