This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.
Frys fraktur-elektronmikroskopi har varit en viktig teknik i ultra forskning i över 40 år. Men bristen på effektiva sätt att studera den molekylära sammansättningen av membran producerat en betydande nedgång i dess användning. Nyligen har det varit en stor väckelse i frysfrakturelektronmikroskopiska tack vare utvecklingen av effektiva sätt att avslöja integralmembranproteiner genom immunogold märkning. En av dessa metoder är känd som tvättmedel-upplöst Freeze-fraktur Replica immunomärkning (FRIL).
Kombinationen av FRIL tekniken med optogenetik tillåter en korrelerad analys av de strukturella och funktionella egenskaper hos centrala synapser. Med denna metod är det möjligt att identifiera och karakterisera både pre- och postsynaptiska neuroner genom sina respektive uttryck av en taggad channelrhodopsin och specifika molekylära markörer. Den distinkta utseende postsynaptiska membranet specialisering av glutamaterga synapser vidare tillåter, vid märkning av jonotropa glutamatreceptorer, för att kvantifiera och analysera intrasynaptic fördelningen av dessa receptorer. Här ger vi en steg-för-steg beskrivning av de förfaranden som krävs för att förbereda parade repliker och hur man immunolabel dem. Vi kommer också att diskutera de varningar och begränsningar FRIL tekniken, i synnerhet de som är förknippade med potentiella provtagnings fördomar. Den höga reproducerbarhet och mångsidigheten hos FRIL tekniken, när de kombineras med optogenetik, erbjuder en mycket kraftfull metod för karakterisering av olika aspekter av synaptisk transmission vid identifierade neuronala mikrokretsar i hjärnan.
Här ger vi ett exempel på hur detta tillvägagångssätt användes för att få en inblick i struktur-funktionssamband av excitatoriska synapser på nervceller i de inskjutna cellmassor med musen amygdala. Framför allt har vi undersökt uttrycket av jonotropiska glutamatreceptorer på identifierade ingångar elleriginated från talamisk posterior intralaminära och mediala geniculate kärnor. Dessa synapser visade sig förmedla sensorisk information som är relevant för rädsla lärande och att genomgå förändringar plast på rädsla konditione.
Definitionen av den funktionella arkitektur biomembran på nanometerskala har ifrågasatts under de senaste åren genom utvecklingen av ett antal immunmärkningen tekniker som är lämpliga för transmissionselektronmikroskopi. Men dessa tekniker, till exempel, före och efter bädda immunogold, har ett antal viktiga begränsningar, bland annat dålig detektering av antigener och / eller begränsad kvantitativ bedömning av membranbundna proteiner. Dessa begränsningar blir särskilt kritisk i utredningen av den fina strukturen av nervsystemet, som kännetecknas av en hög grad av cell mångfald och synaps heterogenitet. Denna heterogenitet resultat från både strukturell och funktionell mångfald dikteras av pre-och postsynaptiska element och av differentialuttryck, anrikning, eller interaktion av signalproteiner, såsom receptorer, transportörer och effektormolekyler.
En ny metod för direkt immunolabeLing av integral eller tvärbundna membranproteiner i tvätt solubiliserad frysfraktur kopior (FRIL) introducerades ursprungligen av Fujimoto två decennier sedan en. Denna ursprungliga metoden hade dock flera begränsningar, det vill säga, svår fragmentering av repliker, som hindrade meningsfull korrelationer av märkta molekyler med individuellt mappade celler i komplexa vävnader såsom hjärnan. Cirka 10 år sedan, Shigemoto och Fukazawa successivt förbättrat tekniken två. Detta parallellt med insatser från en annan grupp av forskare vid Boulder laboratorier State University Colorado, som avsevärt förbättrade också tekniken, i synnerhet för studier av gap-junctions 3.
Förbättringen i frysfrakture protokoll och maskiner, samt införandet av snabbfrysning (under högt tryck), gör nu utredare för att producera obrutna kopior av exemplar av relativt stor storlek och high bilder av hög kvalitet för de flesta cellulära komponenter utan de begränsningar och artefakter som produceras av starka kemiska upptagningar.
Den FRIL teknik erbjuder den stora fördelen med en i hög grad kvantitativ i identifiering av ett eller flera proteiner (samtidigt) i histologiskt mappas och cytologiskt identifierade celler inom komplexa vävnader såsom hjärnan situ, med den ytterligare fördelen med en planvy av pre- och postsynaptiska element i en enskild kopia. Därför FRIL teknik, trots sina många tekniska hinder, håller löftet för ett antal mycket stora vetenskapliga genombrott, särskilt för korrelationen mellan strukturella och funktionella egenskaper hos enskilda synapser. Under de senaste årtiondena har en hel del information har erhållits på strukturen, molekylär göra upp, och fysiologisk funktion av synapser, men synapser är morfologiskt och molekylärt mycket varierande beroende på före och postsynaptiska pahyra nervceller 4. Endast för en handfull synaps typer var struktur-funktionsstudier åstadkommit hittills 5-7. Detta berodde främst på tekniska restriktioner som förhindrade en exakt identifiering av vilken typ av pre-och postsynaptiska element.
Ultra analys har gett värdefull kunskap i variationen av postsynaptiska membran inriktningar över skilda synaptiska kontakter både när det gäller synaptiska storlek och innehåll i neurotransmittorreceptorer 6, som har en stor inverkan på styrkan och plasticitet av synaptisk transmission. Dessutom en stor mängd forskning visar att antalet jonotropa glutamatreceptorer som uttrycks på olika typer av synaps regleras i en afferent- och mål beroende sätt 7-10.
Här är en metod som beskrivs som möjliggör analys av struktur och receptor sammansättningen av postsynaptiska membran inriktningar med definierad presynaptiska element och funktion. Detta tillvägagångssätt drar fördel av presynaptisk uttryck av nyligen utvecklade ljuskänsliga alg proteiner, såsom Channelrhodopsin2 (ChR2), och av FRIL teknik för att analysera mönstret av postsynaptiska uttryck av α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra syra (AMPA-R) och N-metyl-D-aspartat (NMDA-R) glutamatreceptorer. Detta visas vid synapser bildas av axoner som härrör från de bakre thalamus-mediala geniculate kärnor (PIN / MGN) på nervceller i de inskjutna cellmassor i amygdala (ITC). ITC nervceller är små taggiga GABAerga celler organiserade i kluster kring basolaterala amygdaloid komplexet (BLA) 11, 12. ITC neuroner är kända för att ta emot excitatoriska input från BLA huvud neuroner och att rikta den centrala kärnan (CEA), vilket fungerar som en hämmande grind för informationsflödet mellan BLA och Cea 12-15.
Nyligen visade vi att ITC neuron belägna i medio-rygg kluster mellan BLA och CEA får också direkta och konvergerande excitatoriska input från sensoriska talamiska och temporala kortikala regioner, som är modifierade på rädsla lärande under Pavlovian hörsel rädsla konditione 16. Rädsla konditioneringen är en av de bäst förstås former av associativ inlärning i form av hjärnmekanismer. I rädsla luftkonditionering, en initialt neutral betingad stimulus (CS, till exempel, en ton) paras med en aversiv obetingat stimulus (US, t.ex. en mild fotchock) resulterar i en CS-amerikanska föreningen och rade rädsla svar 17, 18. Excitatoriska ingångar från både talamiska och hjärnbarkens områden, som bär information som representerar CS och USA, respektive, var kända för att konvergera på pyramidala nervceller i den laterala kärnan i amygdala (LA) och genomgå plasticitet 19. Vårt tidigare arbete visade att sinnesintryck information finns även parallellt förmedlas till ITC neuroner <supp> 16.
Som ett första steg mot en mekanistisk molekylär analys av enskilda sinnesintryck synapser på ITC nervceller, använde vi en adenoassocierat virus (AAV) för att uttrycka ChR2 taggade med den gula fluorescerande protein (YFP). AAV injicerades i PIN / MGN och axonet terminalerna identifierades genom deras uttryck av ChR2-YFP. Vi använde båda sidor som genereras av FRIL teknik för att bedöma tätheten av postsynaptiska AMPA-R och NMDA-R vid synapser bildas med ITC nervceller av PIN / MGN Axon terminaler.
Frys fraktur-elektronmikroskopi har varit en viktig teknik i ultra forskning i över 40 år. Men bristen på effektiva sätt att studera den molekylära sammansättningen av membran producerat en betydande nedgång i dess användning. Nyligen har det varit en stor väckelse i frysfrakturelektronmikroskop på grund av utvecklingen av effektiva sätt att avslöja integralmembranproteiner genom immunogold märkning 1, 2, nämligen FRIL tekniken.
Den FRIL tekniken besitter flera fördelar jämfört med andra immunogold ultra metoder. Först, proteiner är lätt tillgängliga för antikroppar som ökar känsligheten. För det andra, exponering av stor del av plasmamembran inriktningar, såsom det postsynaptiska membranet, på den tvådimensionella ytan på replika tillåter inspektion av den rumsliga fördelningen och fysiska omedelbar närhet av molekyler av intresse utan mödosam och tidskrävande ombyggnad av serial ultratunna sektioner. För det tredje ökar antalet proteiner som kan märkas för varje enskild struktur, som tillhandahålls lämpliga antikroppar är tillgängliga tillgängligheten av båda halvorna av plasmamembranet. Vid spräckning, är den hydrofoba ytan av den delade membran belagt med kol-platina som befäster proteindomäner som finns kvar på den brutna ytan. Detta förhindrar åtkomst av antikroppar mot antigener i dessa områden. Till exempel på P-ytan av en replik endast epitoper som vetter mot protoplasmautrymmet kan detekteras genom antikroppar, medan å E-face endast epitoper som vetter mot exoplasmic utrymmet kan bindas av antikroppar (se Figur 2).
Å andra sidan, den FRIL tekniken lider också av vissa begränsningar 2. Som frakturer inträffar slumpmässigt, kan det vara svårt att inrikta sig på specifika celler eller strukturer. Detta kan också leda till en samplings bias, till exempel, i synapsen samling, med tanke på de olika sannolikheten för fracturing längs membranet av strukturer med olika krökning (t.ex., ryggar kontra axlar). Dessutom är fördelningen av membranproteiner till ett av de två ytorna oförutsägbar. Därför, fördelningen av ett protein till P-ansikte eller E-ansikte, i synnerhet för kvantitativa studier, bör vara noggrant undersökt med användning av antikroppar som är reaktiva till intracellulära och extracellulära domäner. Slutligen, identifiering i repliken av vissa strukturer, såsom presynaptiska axon terminaler kan vara svårt när endast baseras på morfologiska egenskaper. Emellertid till användningen av specifika antikroppar för markörproteiner eller transduktion av etiketteintegrala membranproteiner eller kanaler med hjälp av virala vektorer erbjuder ytterligare verktyg underlätta identifieringen av de brutna membran. Till exempel tog denna studie fördel av transduktion av ChR2-YFP i talamiska nervceller att identifiera sina axonala efferents i amygdala eller märkningen för μ-opioidreceptorer att avslöja postsynaptiska migmbranes av ITC nervceller.
För att utföra FRIL teknik framgångsrikt, bör särskild försiktighet iakttas om vävnadsfixering. Stark vävnadsfixering (> 2% paraformaldehyd) kan resultera i en hög hastighet av korsfrakturer och en minskning i märkning känslighet. Å andra sidan, svaga upptagningar göra hanteringen vävnad och preparat (t.ex., kapning av sektioner) svår. Det är också viktigt att kontrollera att tjockleken på de trimmade blocken motsvarar tjockleken hos den dubbelsidiga tejpen. Om tjockleken hos provet är lägre än den för bandet, kan ytorna hos vävnaden inte fäster vid ytan av de två metall bärare, är följaktligen de frysta provet inte brutna. Om vävnaden är tjockare, kommer det att komprimeras med oundvikliga strukturella snedvridningar när sandwich av de två kopparbärare görs. Temperaturen vid vilken provet frakturer (i detta protokoll, -115 ° C) spelar också en viktig rollpå strukturen i repliken. Högre temperaturer kan ge en högre frekvens av artefakter såsom kondensation av vattenånga på ytan av vävnaden före eller under avdunstning. Lägre temperaturer (<-125 ° C) kan öka risken för avspjälkning av materialet under sprickbildning. Detta material kan falla på ytan av provet eller hålla kontakten med den. Dessa flingor av material är också belagd och kontrasterade producerar mörka fläckar på bilden. Sprickbildning vid lägre temperaturer kan också påverka frekvensen av korsfrakturer särskilt för små fina strukturer såsom Dendritutskotten. Ett ytterligare kritiskt steg vid framställningen av kopior är detergenten-digestion. Om matsmältningen är ofullständig, visas osmält vävnad som mörka fläckar på kopian, confounding analysen av strukturen på TEM. Dessutom osmält vävnad kan ospecifikt fånga eller binda antikroppar, vilket ökar bakgrunden märkning. Å andra sidan, användning av detergents för vävnads matsmältningen kan denaturera molekylerna är associerade till repliken förändra deras sekundära och tertiära strukturer. Därför, för vissa antigener kan det vara nödvändigt att successivt späda ut koncentrationen av SDS med ytterligare tvättsteg.
För immunomärkning, tillgången på olika storlekar av guldpartiklar konjugerat till sekundära antikroppar gör det möjligt att upptäcka samtidigt, men endast kvalitativt flera proteiner, även i specifika mikrodomäner av plasmamembranet, såsom postsynaptiska specialisering. Men på grund av steriskt hinder, kvantitativa studier är i allmänhet begränsade till påvisande av bara en molekyl. Storleken på guldpartikel kan också påverka effektiviteten märkning.
För tolkningen av märkningen i FRIL, bör man hålla i minnet att immunogold partikeln kan placeras var som helst inom en halvsfär med en radie av 20-25 nm från antigen på grund av den flexibla komplex formed av den primära och sekundära antikroppen 26. För ytterligare information om teori och praktik FRIL och relaterade tekniker, vi hänvisar läsaren även andra metodologiska artiklar 27, 28.
Den FRIL teknik har nyligen använts för högupplösta kvantitativa analyser av glutamatreceptor lokalisering i olika synaps populationer 29, 30. Dessutom känslighet FRIL teknik för AMPA-R upptäckt uppskattades så hög som en immunogold partikel per en funktionell AMPA -R kanal 29. Således är detta tillvägagångssätt överlag mycket användbar för att kvantifiera och analysera mönstret av postsynaptiska uttryck av AMPA-skivor och NMDA-R på central synapser. Här visade vi dess tillämplighet på PIN / MGN-ITC synapser, en webbplats troligen viktigt för att vidarebefordra USA information under rädsla konditione. Användning av en antikropp som tagits fram mot de kraftigt konserverade extracellulära aminosyrarester av de AMPA receptorsubenheter GluA1-GluA4, fann vi en jämn fördelning av guldpartiklar inom IMP kluster motsvarar postsynaptiska membran inriktningar. Densiteten hos AMPA-skivor i ITC ryggar var betydligt högre jämfört med axel synapser som omfattas av PIN / MGN talamiska afferenter. På båda ryggraden och axel synapser, var en positiv korrelation mellan märkning av AMPA-R och postsynaptiska område detekteras Gemensamt för andra glutamaterga synapser 25. Den låga variationen i täthet av AMPA-skivor i PIN / MGN-ITC synapser visar en homogen fördelning liknar andra synapser bildas av talamus efferents 7, men skiljer sig från kortikala synapser 25. Omvänt var tätheten av NMDA-R mer varierande och skilde sig inte mellan ryggraden och axel synapser tyder på en annan reglering än AMPA-skivor. I framtiden kommer den höga reproducerbarhet av FRIL tekniken inte bara göra det möjligt att bedöma de basala molekylära sammansättningen av centrala synapser, men kan underlätta detektion av cHanges i jonotropa glutamatreceptorantalet och subsynaptic fördelning efter rädsla lärande kompletterar ex vivo inspelningar av pre-och postsynaptiska egenskaperna hos dessa ingångar.
Sammanfattningsvis kan detta tillvägagångssätt användas av andra forskare att få en inblick i struktur-funktionssamband av input-specifika excitatoriska synapser i många andra nervbanor där befria den ursprung ingångar samt arten och sammansättningen av postsynaptiska element är avgörande men problematisk .
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.
Surgery | |||
Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectants |
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointments |
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue preparation | |||
Paraformaldehyde EM grade | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
Saturated picric acid solution | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
NaCl | Merck Millipore, Germany | 1064041000 | |
4N NaOH | Carl Roth, Germany | T198.1 | |
Thiopental | Sandoz, Austria | 5,133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, USA | G5516-500ML | |
GenPure ultrapure water system | Thermo Fisher Scientific, USA | 50131235 | |
Peristaltic pump | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
Filter Paper | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High-pressure Freezing | |||
Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
Chamois skin | Household supply store | ||
Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Aceton | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Freeze-fracture and Replication | |||
Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 – 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunolabelling | |||
BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody | ImmunoStar, USA | 24216 | |
EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAG5 | |
EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAR15 | |
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EM analysis | |||
Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |