Transfert de gènes dans l&#39;organe de poulet Auditory par<em&gt; Dans Ovo</em&gt; Micro-électroporation

Lale Evsen; Angelika Doetzlhofer

doi:10.3791/53864

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Article de méthode

Transfert de gènes dans l'organe de poulet Auditory par

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DOI :

10.3791/53864

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17 avril 2016

Lale Evsen¹ , Angelika Doetzlhofer¹

¹The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

Dans cet article

Résumé

L’organe auditif médie l’audition. Nous présentons ici une méthode modifiée de micro-électroporation in ovo optimisée pour l’étude de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices auditives dans l’organe auditif du poulet en développement.

Résumé

Embryons de poulet sont des systèmes modèles idéaux pour l' étude du développement embryonnaire manipulations de la fonction des gènes peuvent être effectuées avec une relative facilité in ovo. L'organe sensoriel auditif de l'oreille interne est essentiel pour notre capacité à entendre. Il abrite un épithélium hautement spécialisé sensorielle qui se compose de cellules ciliées mécano-transduction (CAH) et entourant gliales comme des cellules de soutien (SC). En dépit des différences structurelles dans les organes auditifs, les mécanismes moléculaires qui régulent le développement de l'organe auditif sont évolutivement conservées entre mammifères et aves Dans électroporation ovo est en grande partie limitée aux premiers stades de E1 -. E3. En raison du développement tardif relatif de l'organe auditif à E5, les manipulations de l'organe auditif par électroporation ovo passé E3 sont difficiles en raison du développement avancé de l'embryon de poulet aux stades ultérieurs. La méthode présentée ici est une méthode de transfert de gène transitoire pour le ciblage de gènes d'intérêt àétape E4 - E4.5 dans l'organe sensoriel auditif de poulet en développement par l' intermédiaire d' in ovo micro-électroporation. Cette méthode est applicable à intensité forte et perte de fonctions avec le plasmide classique des vecteurs d'expression à base d' ADN et peut être combiné avec dans un essai de prolifération cellulaire in ovo en y ajoutant EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) pour l'ensemble de l' embryon au le temps de l'électroporation. L'utilisation de la protéine fluorescente verte ou rouge (GFP ou RFP) plasmides d'expression permet à l'expérimentateur de déterminer rapidement si le succès électroporation ciblé la partie auditive de l'oreille interne en développement. Dans cette méthode papier, des exemples représentatifs des spécimens de GFP électroporation sont illustrés; les embryons ont été récoltées 18-96 heures après l' électroporation et le ciblage de la GFP dans la région pro-sensorielle de l'organe auditif a été confirmée par hybridation d' ARN in situ. Le document de la méthode fournit également un protocole optimisé pour l'utilisation de la thymidine analogique EdU pour analyser des cellules prolifration; un exemple d'un essai de prolifération cellulaire sur la base EdU qui combine l'immuno-marquage et cliquer sur le EdU chimie est fourni.

Introduction

En dépit des différences dans la morphologie et la structuration cellulaire entre le mammifère et l' organe sensoriel auditif aviaire, les facteurs moléculaires et les voies responsables du développement de HC sensorielle sont pensés pour être évolutivement conservée ^1-3. La papille basilaire, qui abrite le HCS auditifs et leurs SCs environnantes, se développe comme un outpocketing du otocyste de l'oreille interne. Au début d'une piscine de progéniteurs HC et SC est spécifié dans le / otique domaine compétente tasse neuronal-sensorielle placode otique (NSD). Les données cartographiques destin montrent que les lignées de neurones sensoriels et s....