Rezeptor-Autoradiographie-Protokoll für die Lokalisierte Visualisierung von Angiotensin II-Rezeptoren
Summary
Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt Rezeptorbindungsmuster für Angiotensin II (Ang II) im Gehirn der Ratte ein Radioligand spezifisch für Ang II-Rezeptoren Rezeptor unter Verwendung von Autoradiographie-Mapping durchzuführen.
Gewebeproben werden geerntet und bei -80 ° C gelagert. ist ein Kryostat das Gewebe (Gehirn) und Auftauen montieren die Schnitte auf geladene Objektträger zu koronalen Abschnitt verwendet. Die Objektträger angebrachten Gewebeschnitte werden in 125 I-SI-Ang II inkubiert Ang II – Rezeptoren radioaktiv zu markieren. Benachbarte Objektträger werden in zwei Gruppen unterteilt: "unspezifische Bindung" (NSP) in Gegenwart eines Rezeptor sättigenden Konzentration von nicht-radioaktiv markierten Ang II oder ein AT1 – Ang II – Rezeptor – Subtyp (AT 1 R) selektive Ang II – Rezeptor – Antagonist und ohne AT 1 R – Antagonisten "Gesamtbindung". Einer sättigenden Konzentration von AT 2 Ang II – Rezeptor – Subtyp (AT 2 R) Antagonist (PD123319, 10 uM) ist auch in der incubatiauf Puffer 125 I-SI-Ang II – Bindung an den AT 1 R Subtyp zu begrenzen. Während eines 30 min Vorinkubation bei ~ 22 ° C, NSP Rutschen ausgesetzt sind 10 uM PD123319 und Losartan, während "Gesamtbindung" Dias 10 uM PD123319 ausgesetzt sind. Die Objektträger werden dann mit 125 I-SI-Ang II in Gegenwart von PD123319 für "Gesamtbindung" und PD123319 und Losartan für NSP in Assay – Puffer, gefolgt von mehreren "wäscht" in Puffer inkubiert und Wasser zu entfernen Salz und nicht spezifisch gebundene Radioligand. Die Folien werden mit Schlag-Trockner getrocknet und dann einer Autoradiographie Film belichtet eine spezielle Folie und Kassette. Der Film wird entwickelt und die Bilder werden in einen Computer gescannt für visuelle und quantitative Densitometrie ein proprietäres Bilderzeugungssystem und eine Tabelle verwendet wird. Ein zusätzlicher Satz von Dias werden für die histologische Vergleiche Thionin-gefärbt.
Der Vorteil der Rezeptor-Autoradiographie unter Verwendung ist die Fähigkeit, zu visualisierenAng II – Rezeptoren in situ, in einem Abschnitt einer Gewebeprobe, und anatomisch den Bereich des Gewebes zu identifizieren , indem es zu einem benachbarten histologischen Bezugsabschnitt zu vergleichen.
Introduction
Kardiovaskuläre Erkrankungen weiterhin die häufigste Ursache für Tod und Behinderung in den Vereinigten Staaten zu sein, im Jahr 2011 1 mehr als 30% der Todesfälle in den USA verursacht. Aus den jüngsten Statistiken von der American Heart Association zeigen , dass mehr als eine Person in drei hat ein oder mehr Art von kardiovaskulären Erkrankungen. Kardiovaskuläre Forschung weiterhin Fortschritte gegen das Verständnis dieser Krankheit zu machen, aber als Generationen beginnen immer älter es ist zwingend notwendig, diese Bemühungen fortzusetzen. Das Renin-Angiotensin – System (RAS) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des kardiovaskulären Systems in erster Linie von Atherosklerose, Entzündung, systemische Vasokonstriktion, und die Aktivierung des sympathischen Nervensystems (Figur 1) 2-8 fördern.
Der RAS ist ein Hormonsystem, das aktiviert wird, wenn juxtaglomerulären Zellen der Niere in den Blutstrom Renin in Reaktion absondern, um Blutdruck verringert, erhöht sympathetic Stimulation oder verminderte Natriumfluss durch die Macula densa. Renin-Angiotensinogen metabolisiert (in der Leber synthetisiert) Angiotensin I zu bilden (Ang I). Ang I wird dann durch das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE), ein Ektoenzym auf der luminalen Seite des vaskulären endothelialen Zellen metabolisiert, hauptsächlich in den Lungen und Nieren, Angiotensin II zu bilden (Ang II), das Haupt Effektor Peptid der RAS. Ang II ist in der Lage aktivierenden zwei Rezeptorsubtypen; der Typ 1 – Rezeptor (AT 1 R) und der Typ – 2 – Rezeptor (AT 2 R), die beide die das kardiovaskuläre System zu regulieren, beibehalten Flüssigkeits- und Elektrolyt Homöostase und sind nun die kognitive Funktion zu beeinträchtigen , und neurodegenerative Krankheitsprozessen 8,9 betrachtet. Eine lokale, gehirnspezifische RAS wird berichtet, Ang II unabhängig zu synthetisieren. Im Gehirn wird das Vorläuferprotein Angiotensinogen in Astroglia 10 durch ein Renin-ähnliches Enzym zu Ang I 3 möglicherweise Prorenin umgewandelt synthetisiert, gebunden an den Rezeptor Prorenin11 und überführt anschließend durch das Angiotensin-Converting – Enzym zu Ang II , die reichlich auf der extrazellulären Oberfläche von Neuronen im Gehirn 12 exprimiert wird. Diese intrabrain erzeugt Ang II ist der Agonist für das Gehirn AT 1 und AT 2 Rezeptoren , die von durch Blut übertragbaren Ang II isoliert sind.
Während die AT 1 R eine wichtige physiologische Rolle spielt, ist es für seine pathophysiologischen Wirkungen im ganzen Körper besser bekannt ist , in erster Linie das Herz – Kreislauf – System und die Nieren (Abbildung 2) zu beeinflussen. Wenn Ang II an den R AT 1 bindet, verursacht es eine Vasokonstriktion; zunehmende Resistenz des Blutdrucks, um den Blutfluss und erhöht. Es fördert auch die Synthese und Sekretion von Aldosteron und Vasopressin, zu einer erhöhten Natrium- und Wasserretention führt. Diese Effekte können auch ischämischer Hirnschädigung und kognitiven Störungen induzieren und an der Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Diabetes sowie kürzlich Lernen und Gedächtnis beeinflussen 13-15 identifiziert. Es gibt eine Rückkopplungsschleife in der RAS daß AT 1 R auf den juxtaglomerulären Zellen in der Niere inhibiert Renin – Sekretion. Interessanterweise im Allgemeinen die AT 2 R Gegen regelt die Wirkung von AT 1 R, was zu Vasodilatation, Neuritenwachstum, axonalen Regeneration, Anti-Proliferation und cerebroprotection unter vielen anderen 16-20. Der R AT 2 hat auch als Ziel für Anti-Bluthochdruck und vor kurzem, anti-Krebsmittel 21 identifiziert. Die Bestimmung der Lokalisierung und Dichte von Ang II-Rezeptoren in verschiedenen Geweben und wie werden sie durch verschiedene Behandlungen und Krankheitszuständen mit quantitativen densitometrischen Rezeptor Autoradiographie die Rolle spielt, die RAS in bestimmten Krankheiten aufdecken helfen beeinflusst.
Rezeptor-Autoradiographie wurde seit über 30 Jahren als wirksames Verfahren zum Anzeigen der Anwesenheit von Angiotensin I verwendetI – Rezeptoren und andere Komponenten der RAS im Gehirn und anderen Geweben der Ratte, Maus, Meerschweinchen, Hund und Mensch unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen 22-34. Die Bedeutung Ang II – Rezeptoren der Lokalisierung innerhalb des Gehirns ist , dass eine funktionelle Neuroanatomie zu den Aktionen der Ang II im Gehirn anwenden kann, beispielsweise auf das Vorhandensein von AT 1 R in paraventricularis Nukleus des Hypothalamus (PVN) eine Funktion von Ang II im Gehirn zu stimulieren Vasopressin, Oxytocin oder Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) Freisetzung oder Aktivierung des sympathischen Nervensystems. So Medikamente, die den AT 1 R blockieren könnten mit Überaktivität des Gehirns RAS assoziiert einige dieser PVN-vermittelte Effekte zu verringern. Unfertige legt nahe , dass die Verwendung von AT 1 R – Antagonisten posttraumatische Belastungsstörung (PTSD) -induzierte Freisetzung von CRH verringern und lindern die Symptome von PTSD (Hurt et al., Zur Veröffentlichung eingereicht). Der PVN, subfornicalOrgel (SFO) und Amygdala zur Regulierung der Homöostase, Appetit / Durst, Schlaf, Gedächtnis, emotionale Reaktionen bekannt, und sind die Zielgebiete dieser Demonstration Studie. Diese Regionen wurden durch Sammeln Koronalschnitte eines Gehirns auf Mikroskop-Objektträger untersucht, und Behandeln der Schnitte mit spezifischen Inhibitoren zusammen mit einem spezifischen Radioligand für Ang II-Rezeptoren. In dieser Studie wurden alle Materialien und Reagenzien zusammen mit vorgeschlagen Anbieter aufgelistet sind, wurde Jod-125 verwendet , um einen Ang II – Rezeptor – Antagonist radioaktiv zu markieren, Sarcosin 1, Isoleucin 8 Ang II (SI Ang II), die dann als mono 125 I gereinigt wurde -SI Ang II Methoden unter Verwendung von HPLC wie zuvor 35 beschrieben. Die Verwendung dieser hohen spezifischen Aktivität Radioligand ermöglicht die Visualisierung von Bereichen mit niedriger, mittlerer und hoher Rezeptordichte nach dem Belichten der radiomarkierten Abschnitte Röntgenfilm. Durch den Film mit Gehirn Paste Standards kalibriert bekannten Mengen von Jod-125 enthält, die spezifische MengeRezeptor Ang II in einem Bereich Bindung kann quantifiziert werden. In experimentellen Untersuchungen kann die Ang II-Rezeptor in den Gehirnen von Versuchspersonen Bindung in den Gehirnen von Kontrollpersonen, die verglichen werden. Dies kann angeben, ob die Wirkungen von Ang II in Reaktion auf eine genetisch bedingte Erkrankung verändert sind, phänotypische Abnormalität, Krankheitszustand oder medikamentöse Behandlung. Dieses Wissen kann dann zur Entwicklung von Therapien angewendet werden, Krankheiten, die mit Dysregulation des RAS verbunden zu behandeln. Alternative Techniken , die Rezeptor identifizieren Bindungsstellen, aber mit reduzierter anatomischen Auflösung sind Bindungsassays , die Gewebemembran – Zubereitungen verwenden aus Gewebehomogenisate abgeleitet, die mit dem Radioligand über einen Bereich von Konzentrationen Radioligand – Bindungsaffinität als die Dissoziationskonstante (K D zu bewerten inkubiert ) und die maximale Bindungskapazität (B max) des Gewebes von Interesse.
Das hier beschriebene Protokoll kann in fünf Haupt Co gebrochen werdenmponents: Vorbereiten Gewebeschnitten für Receptor Autoradiographie; Rezeptor-Autoradiographie; Filmbelichtung und Entwicklung; Histologie; und Densitometrische Bildanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll identifiziert die Visualisierung von "total" und "nicht-spezifische" Bindung des Radioliganden in benachbarten Abschnitten der koronalen Abschnitte eines Nagetier Gehirn zuvor geerntet und bei -80 ° C gelagert, und jedes Gewebe leicht auf praktisch sein kann, dass hat anatomisch Unterbauten, die Differential-Display Mengen an Rezeptoren oder Radioligand-Bindungsstellen aufgelöst. Die Verfahren im Protokoll beschrieben sind einfach und die Analyse ist entscheidend für die…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grant HL-113905
Materials
| 500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
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