Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Leigh Ann Samsa; Nicole Fleming; Scott Magness; Li Qian; Jiandong Liu

doi:10.3791/53877

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Article de méthode

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d'embryons de poisson zèbre

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DOI :

10.3791/53877

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12 mars 2016

Leigh Ann Samsa¹^,² , Nicole Fleming²^,³ , Scott Magness¹ , Li Qian²^,³ , Jiandong Liu²^,³

¹Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, ²McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Résumé

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un organisme modèle puissant pour étudier le développement des vertébrés. Bien que de nombreux aspects du développement embryonnaire du poisson-zèbre aient été décrits au niveau morphologique, on sait peu de choses sur la base moléculaire des changements cellulaires qui se produisent au fur et à mesure que l’organisme se développe. Grâce aux progrès récents de la microfluidique et des technologies de multiplexage, il est maintenant possible de caractériser l’expression des gènes dans des cellules uniques. Cela permet d’étudier l’hétérogénéité entre les cellules individuelles de populations cellulaires spécifiques afin d’identifier et de classer les sous-types cellulaires, de caractériser les états intermédiaires qui se produisent lors de la différenciation cellulaire et d’explorer les réponses cellulaires différentielles aux stimuli. Cette étude décrit un protocole permettant d’isoler des cellules uniques viables à partir d’embryons de poisson-zèbre pour des tests de multiplexage à haut débit. Cette méthode peut être rapidement appliquée à tout type de cellule embryonnaire de poisson-zèbre avec des marqueurs fluorescents. Une extension de cette méthode peut également être utilisée en combinaison avec des technologies de séquençage à haut débit pour caractériser complètement le transcriptome de cellules uniques. Comme preuve de principe, l’abondance relative des marqueurs de différenciation cardiaque a été évaluée dans des cellules uniques isolées dérivées de progéniteurs cardiaques positifs nkx2.5. En évaluant l’expression génique au niveau de la cellule unique et à un seul point temporel, les données soutiennent un modèle dans lequel les progéniteurs cardiaques coexistent avec une descendance différenciante. La méthode et le flux de travail décrits ici sont largement applicables à la communauté de recherche sur le poisson-zèbre, ne nécessitant qu’une lignée de poisson transgénique étiquetée et un accès aux technologies de microfluidique.

Introduction

La plupart des études actuelles de biologie cellulaire et moléculaire sont basées sur des moyennes de la population. Cependant, les événements biologiques importants peuvent être masqués par ces analyses basées sur la population traditionnelle puisque les populations mineures peuvent jouer un rôle majeur dans les processus biologiques et les résultats de la maladie. Comprendre l' expression des gènes dans les populations hétérogènes au niveau de la cellule unique peut (et a) conduire à des idées biologiques et cliniques pertinentes ^1,2. Une préoccupation pour les études de développement embryonnaire, dans une plus grande population de cellules, les cel....