결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em> 체외</em> /<em> 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측> 폐 종양 모델
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
본 연구는 특정 돌연변이 배경에 기초하여 약물 반응을 예측 최적화 실리 모델에서와 체외 3D 폐 종양 모델을 조합. 모델은 기저막을 포함한 세포 외 매트릭스 성분과 구조에 관한 조직 – 특이 적 특징을 재현 decellularized 돼지 지지체 상에 생성된다. 우리는 약물 치료 사흘 포함한 14 일 이내에 인공 종양 조직의 생성을 가능하게하는 프로토콜을 표준화. 우리의 기사는 3D의 몇 가지 자세한 설명은 판독 검사 기술의 효과를 평가하기위한 유용한 도구입니다 중간 엽 전이에 M30-ELISA에 의해 상층 액에서 확산 지수 사료된다 염색의, 세포 사멸의 결정 및 상피의 평가 (EMT)처럼 제공 치료 화합물. 우리는 2D 문화에 relat 우리의 3D 종양 모델에서 증식의 감소를 비교 보여줄 수임상 상황에 에드. 이 낮은 확산에도 불구하고, 모델 HCC827 폐 암종 세포주의 비교에 의해 도시 된 바와 같이 정확하게 바이오 마커의 상태에 따른 EGFR -targeted 약물 반응을 예측 (EGFR은 -mutated, KRAS 야생형)와 A549 (EGFR 야생형, KRAS – 티로신 키나제 억제제 (TKI) 피티 니브로 처리) 돌연변이. 멘틴 / 팬 사이토 케라틴 면역 형광 염색에 의해 평가 같은 고급 종양 세포의 약물 반응을 조사하기 위해, 우리는 TGF 베타 1 장기 치료에 의해 유도 EMT. 유동식 생물 반응기는 조직 생성을 향상 생리적 조건으로 배양을 조정하기 위해 사용되었다. 세포 사멸, 증식 지수 EMT – – 부울로 실리 모델 더욱이, 우리는 피티 니브 처리 또는 TGF 베타 1 자극시 약물 반응의 통합을 도시한다. 또한, 우리는 특정 돌연변이 배경 및 카운트를 갖는 종양 세포의 약물 반응 방법을 설명저항에 대한 erstrategies는 예측 될 수있다. 우리는 특히에 실리 확장과 체외 접근 방식에서 우리의 3D는 2 차원 세포 배양에서보다 더 현실적인 조건에서 임상 약물 테스트에 대한 부가 가치를 제공한다는 확신합니다.
Introduction
제약 산업은 막대한 비용 1-5 일으키는 임상 단계에서 암 치료의 분야에서 95 %까지의 높은 마모 속도를 향하게된다. 이 결핍 한 가지 이유는 현재 잠재적 인 새로운 화합물의 효능은 암 세포주의 2D 세포 배양 또는 동물 모델에서의 대규모 스크리닝에서 평가 된 사실이다. 동물 모델은 더 복잡하지만,이 마우스 및 인간 -6,7- 간의 중요한 차이가있다. 지난 10 년간, 다른 접근법을 사용하여 3 차원 암 모델 차원 암 세포주의 배양 및 생체 내의 종양 6,8,9 복잡한 간의 격차를 생성 하였다. 세포 분화에 또한 시그널링 3D 환경의 영향 년전 여러 연구에 도시되어있다 (예., 미나 BISSELL 의해) 10,11. 오늘날, 많은 3D 세포 배양 모델은 회전 타원체 문화, 하이드로 겔 또는 미세 유체 칩 12-16로 사용할 수 있습니다. 심지어 살전하지만전자 모델들은 주로 또한 종양지지 효과 및 영향 약효가 공지 된 미세 조직이없는 종래의 2 차원 배양 시스템에 비해 복잡도를 향상시킨다.
이 문제를 해결하기 위해, 우리는 decellularized 돼지의 소장에서 유래 SISmuc (소 소장 – 점막하 + 점막)라고하는 생물학적 골격에 기초하여 3D 종양 모델을 생성. 따라서, 조직 구조와 같은 다른 콜라겐과 기저막의 구조와 ECM의 중요한 구성 요소 (17)를 유지한다. 이러한 독특한 특징은 상피에서 발생하고 고형 종양의 약 80 %를 포함하는 암의 종양 모델 생성을 위해 중요하다. 또한, 우리의 조직 공학 종양 모델의 확산 속도는 2D 문화에 달성 인위적으로 높은 가격에 비해 감소된다. 확산은 약물 효능을 평가하는 중요한 매개 변수이기 때문에, 약물 검사는 더 비슷한 우리의 모델에서 사용 가능생체에 대한 조건은 17 종양이.
정확하게 자신의 EGFR -biomarker 상태 상이한 두 가지 폐암 세포주를 들어, 여기에서 본 데이터 바이오 마커 약물 의존적 효능을 예측하는 우리의 모델의 가능성을 평가하기 위해. 이 돌연변이 상태는 비소 세포 폐암 환자에서 일상적으로 결정하기 시작했다. 백금 기반 화학 요법 18-21 가진 사람에 비해 활성화 EGFR 돌연변이 쇼 우수한 결과를 베어링 종양에 대한 EGFR -inhibitor 피티 니브로 TKIs와 표적 치료.
우리는 화합물의 효능을 평가하기위한 관련이있는 여러 판독 기술을 설립했다. 또한, TGF 베타 1 자극 이후 우리는 악성 변형 22,23 중요한 단계로 생각되고 약물 resistan 접속되어되는 EMT 프로세스를 시작 암세포 복합 작업을 조사 할 수있다가전 24.
3 차원 종양 모델을 대상으로 치료, 화학 요법, 또는 좋은 대조와 약물의 조합에 세포 특이 반응을 모니터링 할 수 있습니다. 더욱 강화하고 약물 검사의 속도와 저항을 발생하기 위해이가 실리 시뮬레이션에 의해 보완됩니다. 몇몇 실험에 기초하여, 종양 반응 약물 그들의 조합의 전체 범위에 대한 결과에 대하여 인 실리코 예측 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 시험 관내 결합 확립 / 바이오 마커 유도 치료를위한 예측 실리 종양 테스트 시스템이다. 시험 관내 모델은 또한 실리코 (17)에서 시뮬레이션 될 수있는 특정 돌연변이 배경에서 종양 세포 증식 및 아폽토시스의 변화와 같은 복합 작업의 다른 중요한 측면을 평가한다. 여기서는 3D 종양 모델 생성 및 증식 및 아폽토시스의 정량 및 실리코 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 뷔르츠부르크 대학 병원의 학제 임상 연구 (IZKF, 보조금 BD247) 센터와 (헤이 케 Walles 부여) 바이에른 맞춤 프로그램에 의해 후원되었다.
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
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