والأنسجة المشتركة 3D هندسيا<em> في المختبر</em> /<em> في السيليكو</em> الرئة نموذج الورم للتنبؤ فعالية الدواء في خلفيات الطفرات محددة
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
في هذه الدراسة، ونحن معا في المختبر 3D الرئة نموذج الورم مع في نموذج سيليكون لتحسين التنبؤات من الاستجابة للدواء على أساس خلفية طفرة وراثية معينة. يتم إنشاء نموذج على سقالة الخنازير decellularized أن يستنسخ خصائص الأنسجة محددة بشأن تكوين مصفوفة خارج الخلية والهندسة المعمارية بما في ذلك الغشاء القاعدي. نحن موحدة عبارة عن بروتوكول يتيح توليد أنسجة الورم الاصطناعي في غضون 14 يوما بما في ذلك ثلاثة أيام من العلاج من تعاطي المخدرات. تقدم مقالنا عدة وصفا تفصيليا ل3D-تلا تقنيات الفحص مثل تحديد مؤشر انتشار Ki67 تلطيخ، وموت الخلايا المبرمج من supernatants بواسطة M30-ELISA وتقييم الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، والتي هي أدوات مفيدة لتقييم فعالية المركبات العلاجية. نحن يمكن أن تظهر مقارنة ثقافة 2D الحد من الانتشار النووي في نموذجنا الورم 3D الذي هو تعصبإد إلى الحالة السريرية. وعلى الرغم من هذا الانتشار أقل من ذلك، توقع نموذج EGFR الردود المخدرات -targeted بشكل صحيح وفقا لحالة العلامات البيولوجية كما يتضح من المقارنة بين خطوط الخلايا السرطانية في الرئة HCC827 (-mutated EGFR، KRAS من النوع البري) وA549 (EGFR من النوع البري، KRAS – تحور) تعامل مع gefitinib التيروزين كيناز المانع (TKI). للتحقيق استجابات المخدرات من الخلايا السرطانية أكثر تقدما، ونحن يسببها EMT عن طريق العلاج طويل الأمد مع TGF-بيتا-1 وفقا لتقييم فيمنتين / تلطيخ المناعي لعموم cytokeratin. كان يعمل A-مفاعل حيوي تدفق لضبط الثقافة إلى الظروف الفسيولوجية، مما أدى إلى تحسن الجيل الأنسجة. وعلاوة على ذلك، نقدم لك مجموعة من التكامل الردود المخدرات على العلاج gefitinib أو مركب بيتا-1 التحفيز – موت الخلايا المبرمج، مؤشر انتشار وEMT – إلى منطقية في نموذج سيليكون. بالإضافة إلى ذلك، نفسر ردود كيف المخدرات من الخلايا السرطانية مع خلفية طفرة وراثية معينة والعدerstrategies ضد المقاومة يمكن التنبؤ. ونحن على ثقة بأن لدينا 3D في نهج المختبر وخاصة مع التوسع في سيليكون ويوفر قيمة إضافية لاختبار المخدرات قبل السريرية في ظروف أكثر واقعية مما كانت عليه في خلية ثقافة 2D.
Introduction
تواجه صناعة الأدوية معدلات الاستنزاف عالية تصل إلى 95٪ في مجال علاج السرطان في المرحلة السريرية تسبب التكاليف الباهظة 1-5. وأحد أسباب هذا العجز هو حقيقة أنه في الوقت الراهن يتم تقييم فعالية من المركبات الجديدة المحتملة في العروض على نطاق واسع في مزارع الخلايا 2D من خطوط الخلايا السرطانية أو في النماذج الحيوانية. نماذج حيوانية لديها تعقيد أعلى ولكن هناك اختلافات مهمة بين الفئران والرجال 6،7. في العقد الماضي، تم إنشاء السرطان نماذج 3D باستخدام أساليب مختلفة من أجل سد الفجوة بين الثقافة 2D من خطوط الخلايا السرطانية ومجمع في 6،8،9 الجسم الحي الورم. وقد تبين أن تأثير البيئة 3D على تمايز الخلايا وأيضا على إشارات في العديد من الدراسات منذ سنوات (على سبيل المثال، عن طريق ميناء بيسيل) 10،11. اليوم، تتوفر العديد من النماذج ثقافة الخلية 3D مثل الثقافات كروي، الهلاميات المائية أو رقائق ميكروفلويديك 12-16. على الرغم من تساالنماذج الإلكترونية تعزز التعقيد مقارنة بأنظمة ثقافة 2D التقليدية، أنها تفتقر في الغالب المكروية الأنسجة التي من المعروف أن يكون لها آثار الداعمة للورم، وكذلك آثار المخدرات فعالية.
لمعالجة هذه المسألة، ولدت لنا نموذجا الورم 3D بناء على سقالة بيولوجية تسمى SISmuc (-الأمعاء الدقيقة، تحت المخاطية + الغشاء المخاطي) مشتق من الصائم الخنازير decellularized. وبالتالي، فإن هيكل الأنسجة وعناصر هامة من ECM مثل الكولاجين مختلفة فضلا عن هيكل الغشاء القاعدي يتم الاحتفاظ 17. هذه الميزة الفريدة أمر حاسم لتوليد نموذج ورم من الأورام السرطانية التي تنشأ من ظهائر ويشكلون نحو 80٪ من الأورام الصلبة. وعلاوة على ذلك، يتم خفض معدل انتشار في نموذجنا ورم الأنسجة المهندسة بالمقارنة مع معدلات مرتفعة بشكل مصطنع المحرز في ثقافة 2D. كما الانتشار هو معيار مهم في تقييم فعالية الدواء، يتم تمكين اختبار المخدرات في نموذجنا في أكثر مماثلةالشروط في الجسم الحي الأورام 17.
من أجل تقييم إمكانات نموذجنا للتنبؤ نجاعة الأدوية التي تعتمد على العلامات البيولوجية بشكل صحيح، ونحن البيانات الحالية هنا لمدة لمختلف خطوط الخلايا السرطانية في الرئة التي تختلف في حالة EGFR -biomarker بهم. وقد بدأ هذا الوضع تغيري يتم تحديدها بشكل روتيني للمرضى NSCLC. العلاجات المستهدفة مع TKIs مثل EGFR -inhibitor gefitinib ضد الأورام التي تحمل لتفعيل EGFR طفرة تظهر نتائج متفوقة مقارنة مع تلك البلاتيني العلاج الكيميائي 18-21.
أنشأنا عدة تقنيات تلا التي هي ذات الصلة لتقييم فعالية مركب. وعلاوة على ذلك، بعد TGF-بيتا-1 التحفيز ونحن قادرون على تحقيق أعمال المجمع في الخلايا السرطانية التي بدأت عملية EMT، والتي يعتقد أن تكون خطوة هامة في التحول السرطاني 22،23 والتي يتم توصيلها إلى resistan المخدراتم 24.
نموذج الورم 3D تسمح بمراقبة استجابات معينة من الخلايا للعلاجات مستهدفة، والعلاج الكيميائي، أو مزيج المخدرات مع التناقضات جيدة. لتعزيز وتسريع المخدرات الفرز ولمواجهة المقاومة، وهذا ما تكملها في محاكاة سيليكون. وبناء على عدد قليل من التجارب، واستجابة الورم يمكن التنبؤ في سيليكون بشأن نتائج لمجموعة كاملة من المخدرات ومجموعاتها.
Protocol
Representative Results
Discussion
أنشأنا جنبا إلى جنب في المختبر / في SILICO نظام اختبار الورم للتنبؤات العلاج الموجهة العلامات البيولوجية. نموذج في المختبر بتقييم مختلف الجوانب الهامة من الإجراءات مركب مثل التغيرات من انتشار الخلايا السرطانية والخلايا على خلفية طفرة وراثية محددة يمكن أيضا أ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد رعت هذا البحث من قبل مركز التخصصات السريرية البحوث (IZKF، منحة BD247) من مستشفى جامعة فورتسبورغ وبرنامج بايرن صالح (الممنوحة لهايكه اليس).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- . . Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , (2013).
- . . BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
