Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em> In Vitro</em> /<em> In Silico</em> Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
In de onderhavige studie en we een in vitro 3D longtumor model met een in silico model voorspellingen van geneesmiddelrespons optimaliseren op basis van een specifieke mutatie achtergrond. Het model wordt gegenereerd op een cellen ontdane varkens scaffold dat weefsel-specifieke kenmerken met betrekking tot de extracellulaire matrix samenstelling en architectuur met inbegrip van het basaal membraan reproduceert. We gestandaardiseerd een protocol dat kunstmatige tumorweefsel generatie maakt het mogelijk binnen 14 dagen, waaronder drie dagen van de behandeling met geneesmiddelen. Ons artikel biedt een aantal gedetailleerde beschrijvingen van 3D uitlezen screening technieken zoals het bepalen van de proliferatie-index Ki67 kleuring's, apoptose van supernatanten door M30-ELISA en beoordeling van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), die handige tools zijn voor de evaluatie van de effectiviteit van therapeutische verbindingen. We konden aantonen in vergelijking met 2D-cultuur een vermindering van de proliferatie in onze 3D-tumor model dat related aan de klinische situatie. Ondanks deze lagere proliferatie, het model voorspelde EGFR -targeted drug reacties correct volgens de biomarker toestand zoals getoond door vergelijking van de long carcinoma cellijnen HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) en A549 (EGFR wildtype KRAS – gemuteerd) behandeld met de tyrosine-kinaseremmer (TKI) gefitinib. Drug reacties van geavanceerdere tumorcellen te onderzoeken, geïnduceerd we EMT door langdurige behandeling met TGF-beta-1 zoals vastgesteld met vimentine / pan-cytokeratine immunofluorescentie kleuring. Een stroom-bioreactor werd gebruikt om cultuur aan te passen aan fysiologische omstandigheden, waardoor weefsel generatie verbeterd. Verder laten we zien de integratie van de drug reacties op gefitinib behandeling of TGF-beta-1 stimulatie – apoptose, proliferatie-index en EMT – in een Booleaanse in silico model. Daarnaast leggen we uit hoe drug reacties van tumorcellen met een specifieke mutatie achtergrond en tellenerstrategies tegen weerstand kan worden voorspeld. We zijn ervan overtuigd dat onze 3D in vitro aanpak vooral met haar in silico uitbreiding biedt een toegevoegde waarde voor preklinische testen van geneesmiddelen in meer realistische omstandigheden dan in 2D celkweek.
Introduction
De farmaceutische industrie wordt geconfronteerd met hoge verloop van maximaal 95% op het gebied van de behandeling van kanker in de klinische fase veroorzaakt enorme kosten 1-5. Een reden hiervoor tekort dat momenteel werkzaamheid van potentiële nieuwe verbindingen worden geëvalueerd in grootschalige screenings 2D celculturen van kanker cellijnen of diermodellen. Dierlijke modellen hebben een hogere complexiteit, maar er zijn cruciale verschillen tussen muizen en mannen 6,7. In de afgelopen tien jaar hebben 3D-modellen van kanker met behulp van verschillende benaderingen gegenereerd om de kloof tussen 2D cultuur van kanker cellijnen en een complex in vivo tumor 6,8,9 overbruggen. Het effect van 3D omgeving op celdifferentiatie en ook signalering is aangetoond in verschillende studies jaren geleden (bv. Door Mina Bissell) 10,11. Tegenwoordig hebben veel 3D celcultuur modellen zijn beschikbaar, zoals spheroïde culturen, hydrogels of microfluïdische chips 12-16. Hoewel these modellen verbeteren complexiteit in vergelijking met conventionele 2D kweeksystemen, ze meestal niet over een tissue micro waarvan bekend is dat tumor-ondersteunende effecten en ook effecten werkzaamheid van het geneesmiddel te hebben.
Om dit probleem genereerden wij een 3D tumormodel gebaseerd op biologische scaffold genaamd SISmuc (small-darm-mucosa submucosa +) die is afgeleid van een van cellen ontdane varkens jejunum. Bijgevolg de weefselarchitectuur en belangrijke bestanddelen van de ECM zoals verschillende collagenen en de basale membraan structuur behouden 17. Deze unieke eigenschap is essentieel voor tumormodel generatie carcinomen die ontstaan uit epithelia en omvatten ongeveer 80% vaste tumoren. Verder wordt de proliferatiesnelheid in onze weefselengineering tumormodel verlaagd in vergelijking met de kunstmatig hoge bereikt 2D cultuur. De proliferatie is een belangrijke parameter bij het beoordelen van werkzaamheid van het geneesmiddel wordt testende ingeschakeld in ons model meer vergelijkbaarvoorwaarden in vivo tumoren 17.
Om het potentieel van ons model biomarker-afhankelijke drugdoeltreffendheid correct, wij hier presenteren gegevens voor twee verschillende longkanker cellijnen die verschillen in hun EGFR -biomarker toestand voorspellen evalueren. Deze mutatiestatus is begonnen met het routinematig worden bepaald NSCLC patiënten. Gerichte behandelingen met TKI's, zoals de EGFR -inhibitor gefitinib tegen tumoren dragende een activerende EGFR-mutatie vertonen superieure resultaten in vergelijking met mensen met een platina gebaseerde chemotherapie 18-21.
Wij vestigden enkele uitlezing technieken die relevant zijn voor de beoordeling van samengestelde werkzaamheid. Verder na TGF-beta-1 stimulatie kunnen we verbinding acties op tumorcellen die het EMT proces, waarvan men denkt dat een belangrijke stap bij maligne transformatie 22,23 en die verbonden is met geneesmiddel begonnen onderzoeken resistance 24.
De 3D-tumor model mogelijk toezicht op cel-specifieke reacties op gerichte behandelingen, chemotherapie, of combinaties van geneesmiddelen met een goede contrasten. Om verder te verbeteren en te versnellen drug-screening en de weerstand stuiten, wordt dit aangevuld met een in silico simulatie. Op basis van een aantal experimenten, kan de tumor respons worden voorspeld in silico met betrekking tot de uitkomst van een volledig assortiment van drugs en combinaties daarvan.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben vastgesteld een gecombineerde in vitro / in silico tumor testsysteem voor biomarker geleide behandeling voorspellingen. De in vitro model evalueert verschillende belangrijke aspecten van verbinding maatregelen zoals veranderingen van proliferatie en apoptose van tumorcellen op een specifieke mutatie achtergrond die ook kan worden gesimuleerd in silico 17. Hier presenteren we het gestandaardiseerd protocol voor 3D-tumor model generatie en verbinding testen met kwantificerin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesponsord door het Centrum voor Interdisciplinair Clinical Research (IZKF, subsidie BD247) van het Universitair Ziekenhuis van Würzburg en de Bayern Fit-programma (toegekend aan Heike Walles).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- . . Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , (2013).
- . . BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
