En Kombinert 3D Tissue Konstruert<em> In Vitro</em> /<em> I Silico</em> Lung Tumor modell for å forutsi Drug Effective i Spesifikke mutasjons bakgrunner
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
I denne studien har vi samlet en in vitro 3D lungetumoren modell med en in silico modell for å optimalisere spådommer om narkotika respons basert på en bestemt mutasjons bakgrunn. Modellen blir generert på en decellularized porcint stillas som gjengir vevsspesifikke egenskaper når det gjelder ekstracellulær matriks sammensetning og arkitektur, inkludert basalmembranen. Vi standardisert en protokoll som tillater kunstig svulstvev generasjon innen 14 dager inkludert tre dager med behandling. Vår artikkel gir flere detaljerte beskrivelser av 3D leses ut screeningteknikker som fastsettelse av spredning indeksen Ki67 flekker tallet, apoptose fra supernatanter av M30-ELISA og vurdering av epitelial til mesenchymale overgang (EMT), som er nyttige verktøy for å evaluere effekten av terapeutiske forbindelser. Vi kunne vise i forhold til 2D kultur en reduksjon av spredning i vår 3D-tumor modell som er related til den kliniske situasjonen. På tross av denne nedre spredning, forutsagt av modellen EGFR -targeted stoffresponser på riktig måte i henhold til biomarkør status som vist ved sammenligning av de lunge karsinom-cellelinjer HCC827 (EGFR -mutated, KRAS villtype) og A549 (EGFR villtype, KRAS – muterte) behandlet med tyrosin-kinase-inhibitor (TKI) gefitinib. For å undersøke narkotika reaksjoner fra mer avanserte kreftceller, vi indusert EMT ved langtidsbehandling med TGF-beta-1 som vurderes av vimentin / pan-cytokeratin immunfluorescens farging. En strømnings-reaktor ble anvendt for å justere kultur til fysiologiske betingelser, noe som forbedret vev generasjon. Videre viser vi integrering av narkotika respons på gefitinib behandling eller TGF-beta-en stimulering – apoptose, spredning indeks og EMT – inn i en boolsk i silico modell. I tillegg forklarer vi hvordan stoffet svarene av tumorceller med et spesifikt mutasjons bakgrunn og tellingerstrategies mot motstand kan forutsies. Vi er sikre på at vår 3D in vitro tilnærming spesielt med sin i silico utvidelsen gir en ekstra verdi for prekliniske narkotika testing i mer realistiske forhold enn i 2D cellekultur.
Introduction
Legemiddelindustrien står overfor høye frafallsrater på opp til 95% innen kreftbehandling i den kliniske fase forårsaker enorme kostnader 1-5. En årsak til dette underskuddet er det faktum at i dag effekten av eventuelle nye forbindelser vurderes i storskala screenings på 2D cellekulturer av kreft cellelinjer eller i dyremodeller. Dyremodeller har høyere kompleksitet, men det er viktige forskjeller mellom mus og menn 6,7. I det siste tiåret, har 3D-kreft modeller med ulike tilnærminger blitt generert for å bygge bro over gapet mellom 2D kultur av kreftcellelinjer og en kompleks in vivo tumor 6,8,9. Virkningen av 3D-miljø på celledifferensiering og også på signal har vært vist i flere studier år siden (f.eks. Ved Mina Bissell) 10,11. I dag er mange 3D cellekultur modeller er tilgjengelige for eksempel sfæroide kulturer, hydrogeler eller microfluidic chips 12-16. Selv om These modeller forbedre kompleksitet i forhold til konvensjonelle 2D kultur-systemer, de mangler det meste en vev mikromiljø som er kjent for å ha kreftbærende effekter, og også påvirker narkotika effekt.
For å løse dette problemet, vi generert en 3D-tumor modell basert på en biologisk stillas kalt SISmuc (små-tarm-submucosa + slimhinnen) som er avledet fra en decellularized svin jejunum. Derved blir det vevsarkitektur og viktige komponenter i ECM slik som forskjellige kollagener samt basalmembranen struktur bevares 17. Denne unike funksjonen er avgjørende for svulst modell generasjon av karsinomer som oppstår fra epitel og utgjør ca 80% av solide svulster. Videre er formeringshastigheten i vår vev-konstruert tumormodell redusert i forhold til den kunstig høye priser oppnådd i 2D kultur. Som spredning er en viktig parameter for å vurdere legemidlets effekt, er narkotika testing aktivert i vår modell i mer likforhold til in vivo svulster 17.
For å vurdere potensialet for vår modell for å forutsi biomarkør-avhengig legemidlets effekt på riktig måte, vi her angir data for to forskjellige lungecancer cellelinjer som skiller seg i sin EGFR -biomarker status. Denne mutasjonsstatus har begynt å bli bestemt rutinemessig i NSCLC pasienter. Målrettede behandlinger med TKI som EGFR -hemmer gefitinib mot svulster som bærer en aktiverende EGFR mutasjon viser overlegne resultater i forhold til de med platina-basert kjemoterapi 18-21.
Vi etablerte flere avlesnings teknikker som er relevante for vurdering av sammensatte effekt. Videre, etter TGF-beta-en stimulering vi er i stand til å undersøke sammensatte handlinger i kreftceller som startet EMT prosessen, som er tenkt å være et viktig skritt i ondartet transformasjon 22,23 og som er koblet til narkotika resistance 24.
3D-tumor modell tillater overvåking celle-spesifikke responser til målrettede behandlinger, kjemoterapi eller medikamentkombinasjoner med gode kontraster. For ytterligere å forbedre og øke hastigheten på narkotika-screening og for å møte motstand, er dette supplert med en in silico simulering. Basert på noen eksperimenter, kan tumorrespons bli spådd i silico om utfallet for et bredt spekter av legemidler og kombinasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har etablert en kombinert in vitro / in silico svulst testsystem for biomarkør styrt behandling spådommer. Den in vitro modell evaluerer forskjellige viktige aspekter ved sammensatte handlinger, for eksempel endringer i tumorcelle-proliferasjon og apoptose på en spesifikk mutasjons bakgrunn som også kan simuleres i silico 17. Her presenterer vi den standardiserte protokollen for 3D-tumor modell generasjon og sammensatte testing inkludert kvantifisering av spredning og apoptos…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble sponset av Senter for tverrfaglig klinisk forskning (IZKF, tilskudd BD247) ved Universitetssykehuset i Wuerzburg og Bayern Fit-programmet (gitt til Heike Walles).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- . . Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , (2013).
- . . BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
