Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1<sup> hoog</sup>-Vetcellen afgeleide stamcellen (ASC)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
Stamcel antigeen 1 (SCA1 of Ly6A / E) werd voor het eerst geïdentificeerd als een celoppervlak marker door hematopoietische en mesenchymale stamcellen 5,6 uitgedrukt. De stromale vasculaire fractie (SVF) van vetweefsel verkregen uit muizen vetdepots een heterogene populatie van cellen omvattende fibroblasten, macrofagen, vasculaire endotheelcellen, neuronale cellen, adipocyten en progenitorcellen 7. Adipocyten voorlopercellen of adipeus afgeleide stamcellen (ASC) zijn niet lipide beladen cellen die in het collageen-rijke perivasculaire extracellulaire matrix (ECM) 8 bevinden. Ongeveer 50% van de SVF uit ASC, die worden gekenmerkt als lineage-negatieve (Lin -) en CD29 +: CD34 +: SCA1 + 9. De meeste van deze cellen SCA1 +: CD24 – adipocyten stamcellen die in staat adipocytdifferentiatie in vitro; echter slechts een fractie van cellen (0,08% van SVF) vormt SCA1 <sup> +: CD24 + cellen die volledig in staat prolifereren en differentiëren tot adipocyten bij de in vivo omstandigheden 9 zijn. Ondanks het potentieel nadeel van het gebruik SCA1 + SVF zonder discriminatie CD24 + cellen van CD24 – cellen isoleren SCA1 + ASC's uit vetdepots gebruik immunomagnetische celscheiding is een efficiënte en praktische benadering van de cel-autonome fenotype van primaire adipocyten progenitorcellen te bepalen.
Op het gebied van obesitas en diabetes, weefsel fibrose en ontsteking spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en instandhouding van type 2 diabetes 3. Recentelijk Tokunaga et al. toonde aan dat SCA1 hoge cellen geïsoleerd uit de lies (of subcutane, SQ) en perigonadal (of viscerale, VIS) C57BL6 / J vet depots vertonen ander gen handtekeningen en ECM remodeling in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), een prototypisch lid van de membraan-tYpe matrix metalloproteinase (MMP) familie bemiddelt de ontwikkeling van wit vetweefsel (WAT) via haar collagenolytische activiteit 1.
Voorbeelden van experimenten die kan worden uitgevoerd met de cellen geïsoleerd en verrijkt door de volgende protocol omvatten drie-dimensionale cultuur, differentiatie studies, collageen degradatie assays, en RNA-sequencing 10,11. Degradatie assays worden uitgevoerd met zuur geëxtraheerd collageen dienen om de telopeptide 11,12 waarborgen. Het volgende protocol zal de methoden aantonen primaire vasculaire stromale cellen te isoleren uit verschillende vetdepots en verrijken adipocyten progenitorcellen via immunomagnetische celscheiding. De geldigheid van de cel sortering zal worden beoordeeld met flowcytometrie en door het gebruik van SCA1-GFP muizen die GFP in SCA1 + cellen uit te drukken, aangedreven door een SCA1 promotor 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin tonen we de isolatie en immunomagnetische celscheiding van murine ASC's uit verschillende vetkussentjes en hun gebruik voor in vitro experimenten. De onderhavige methode is effectief voor de snelle isolatie van talrijke SCA1-positieve ASC, hetgeen voordelig via technisch complexe en dure FACS gemedieerde isolatie van ASC 9,14. Unlike FACS gaat immunomagnetische celscheiding niet het gebruik van meerdere antigeen voor de identificatie van een doelwit celpopulatie toelaten. Niettemin, als he…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH DK095137 (THC). Wij danken de huidige en voormalige lab-leden die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling en verfijning van de beschreven methoden.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
