Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica<sup> alta</sup> derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
Staminali antigene cella 1 (Sca1, o Ly6A / E) per la prima volta identificata come un marcatore di superficie cellulare espressa da ematopoietiche e mesenchimali staminali cellule 5,6. La frazione vascolare stromale (SVF) di tessuto adiposo ottenuto da depositi di grasso del mouse è una popolazione eterogenea di cellule che compongono dei fibroblasti, macrofagi, cellule endoteliali vascolari, cellule neuronali e cellule progenitrici degli adipociti 7. Cellule progenitrici degli adipociti, o le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (CSA) sono cellule non carichi di lipidi che si trovano nella matrice extracellulare perivascolare ricchi di collagene (ECM) 8. Circa il 50% della SVF costituiti da ASC, caratterizzati come lineage-negative (Lin -) e CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La maggior parte di queste cellule sono Sca1 +: CD24 – progenitori adipociti, che sono capaci di adipociti differenziazione in vitro; Tuttavia, solo una frazione di cellule (0,08% del SVF) costituisce Sca1 <sup> +: CD24 + cellule che sono pienamente in grado di proliferare e differenziarsi in adipociti nelle condizioni in vivo 9. Nonostante il potenziale avvertenza di usare Sca1 + SVF senza discriminare le cellule CD24 + CD24 da – cellule, isolando Sca1 + ASC da depositi di grasso che utilizzano la separazione immunomagnetica è un approccio efficiente e pratico per determinare il fenotipo delle cellule-autonoma di cellule progenitrici degli adipociti primaria.
Nel campo di obesità e diabete, fibrosi dei tessuti e l'infiammazione gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella manutenzione del diabete di tipo-2 3. Recentemente, Tokunaga et al. hanno dimostrato che le cellule di alta SCA1 isolate da inguinale (o sottocutanea, SQ) e perigonadal (o viscerale, VIS) depositi di grasso C57BL6 / J mostrano diverse firme genetiche e ECM rimodellamento in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un membro prototipico della membrana-tmatrix ipo metalloproteinasi (MMP) famiglia media lo sviluppo di tessuto adiposo bianco (WAT), attraverso la sua attività collagenolitica 1.
Esempi di esperimenti che possono essere eseguite con le cellule isolate e arricchite attraverso il seguente protocollo includono cultura tridimensionale, studi di differenziazione, saggi di degradazione del collagene, e RNA sequenziamento 10,11. Test di degradazione devono essere condotte con il collagene acido estratto per garantire la conservazione di telopeptide 11,12. Il seguente protocollo dimostrerà i metodi per isolare le cellule stromali vascolari primarie da diversi depositi di grasso e di arricchire le cellule progenitrici degli adipociti utilizzando separazione immunomagnetica. La validità della separazione delle cellule sarà valutata con la citometria a flusso e attraverso l'utilizzo di topi Sca1-GFP che esprimono GFP in Sca1 + cellule, guidata da un promotore Sca1 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui dimostriamo l'isolamento e la separazione immunomagnetica cellule di ASC murine da diversi cuscinetti di grasso e il loro utilizzo per esperimenti in vitro. Il metodo presentato è efficace per la rapida isolamento di un gran numero di ASC SCA1-positivo, che è vantaggiosa sulla tecnicamente complessi e costosi isolamento FACS-mediata di ASC 9,14. Diversamente FACS, separazione immunomagnetica non consente l'uso di antigeni multipli per l'identificazione di una popolazione di cellule …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto da NIH DK095137 (al THC). Ringraziamo i membri del laboratorio attuali ed ex che hanno contribuito allo sviluppo e alla sofisticazione dei metodi descritti.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
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